楊 旋, 曾斌芳,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830000)

非酒精性脂肪肝(non-alcohol fatty liver disease, NAFLD)定義為排除其他肝臟脂肪變性原因(包括其他肝臟疾病原因、過度飲酒和其他可能導(dǎo)致肝臟脂肪變性的情況)后，仍存在肝臟脂肪堆積。NAFLD并非靜止性病變，它可在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)肝臟造成不可逆的損傷，有很大機(jī)率將發(fā)展為肝硬化和終末期肝病，NAFLD的患病率普遍上升[1]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚沒有明確，其中以“二次打擊學(xué)說”影響力最廣、最為學(xué)者們所認(rèn)同。胰島素抵抗(IR)所導(dǎo)致的肝內(nèi)脂肪沉積是NAFLD發(fā)病過程的第一次打擊，同時(shí)IR也是NAFLD發(fā)病過程中的中心環(huán)節(jié)之一[2]。本研究依據(jù)“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”和“肝腎同源”等傳統(tǒng)之理論，自擬經(jīng)驗(yàn)方芪茵顆粒治療NAFLD，并經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用，療效得到了廣大患者的肯定。通過觀察芪茵顆粒對(duì)NAFLD細(xì)胞模型(FFA)、LEP及RETN水平的影響，探討其對(duì)NAFLD的IR途徑的治療作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物L(fēng)O2細(xì)胞株由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室所提供。雄性SPF級(jí)SD大鼠 6只，體質(zhì)量(200±20) g，由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào): SYXK(新)2018-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物芪茵顆粒免煎劑( 由黃芪、茵陳蒿、生山楂、補(bǔ)骨脂、澤瀉、決明子、生大黃、三七組成) ，購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。硫普羅寧片( 河南省新宜藥業(yè)有限公司，批號(hào): P20150307-2)。

1.3 試劑與儀器RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清蛋白(BSA)、油酸鈉、棕櫚酸鈉、噻唑鹽(MTT)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司),油紅O染色液(Solarbio)游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),人抵抗素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司),人瘦素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),倒置顯微鏡(浙江賽德儀器設(shè)備有限公司)、酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清制備 將體質(zhì)量在180～200 g的36只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、中藥制劑芪茵顆粒組、陽(yáng)性藥物硫普羅寧組，每組12只。芪茵顆粒組以5 g/kg體質(zhì)量的中藥免煎劑灌胃給藥、硫普羅寧組以20 mg/kg體質(zhì)量的劑量灌胃給藥，空白組予以20 mL/kg體質(zhì)量的蒸餾水灌胃。每日分早晚2次，連續(xù)灌胃給藥5次。處理動(dòng)物12 h前，大鼠進(jìn)食不禁水，次日末次給藥1 h后測(cè)量體重并記錄，用10%水合氯醛(3 mL/kg體質(zhì)量)行腹腔注射麻醉術(shù)，沿腹正中線做“Y”切口，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心10 min后取上清備用。將血液上清分裝于5 mL凍存管，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾滅菌，-80℃冰箱保存。

1.4.2 NAFLD細(xì)胞模型造模方法取 L02 細(xì)胞株，用含 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，取4～7代內(nèi)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將離體培養(yǎng)的L02細(xì)胞以合適密度接種于96孔板和(或)24孔板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將適宜濃度的游離脂肪酸(OA∶PA=2∶1)接種板內(nèi)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 NAFLD細(xì)胞模型最佳造模條件的確定

1.4.3.1 游離脂肪酸(FFA)作用濃度及時(shí)間的確定 據(jù)“1.4.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法，將細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，將板內(nèi)細(xì)胞分為對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入含1%BSA無血清培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)組加入含不同濃度的FFA培養(yǎng)基(分別為0.25、0.5、0.75、1 mmol/L),每組5個(gè)復(fù)孔。干預(yù)12、24 h后，用MTT分析法測(cè)試細(xì)胞情況，以確定FFA的最佳作用濃度及時(shí)間。

1.4.3.2 細(xì)胞內(nèi)脂滴觀察 據(jù)“1.4.3.1”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，將細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的FFA培養(yǎng)基(濃度分別為0.25、0.5、0.75、1 mmol/L),每組3個(gè)復(fù)孔，干預(yù)24 h后，采用油紅O染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脂肪變性觀察，染色結(jié)果：中性脂肪呈橙紅色、磷脂呈粉紅色、細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.4.4 含藥血清的作用濃度及時(shí)間的確定 將細(xì)胞以1×105密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、含藥血清組、模型組?？瞻讓?duì)照組正常換液，含藥血清組及模型組根據(jù)“1.4.3.1”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果在細(xì)胞內(nèi)加入FFA培養(yǎng)基干預(yù)后，吸去培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，將含藥血清組加入不同濃度的芪茵顆粒含藥血清配制(含藥血清濃度分別為5%、10%、15%、20%)的含藥血清培養(yǎng)基，空白對(duì)照組和模型組加入含10%胎牛血清培養(yǎng)基，干預(yù)12、24 h后，用MTT分析法測(cè)試細(xì)胞抑制率，把抑制率達(dá)50%的值(IC50)設(shè)為芪茵顆粒中劑量濃度、將IC50值上調(diào)1倍設(shè)為芪茵顆粒高劑量濃度,將IC50值下調(diào)1倍設(shè)為芪茵顆粒低劑量濃度。陽(yáng)性藥物硫普羅寧含藥血清測(cè)定方法同上。

1.5 分組與觀察指標(biāo)

1.5.1 對(duì)NAFLD細(xì)胞模型細(xì)胞分組 將細(xì)胞以1×105密度接種于96孔板，24 h后取其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組、芪茵顆粒高劑量組、芪茵顆粒中劑量組、芪茵顆粒低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，除空白對(duì)照組外各組均加入FFA高脂培養(yǎng)基，空白組繼續(xù)用10%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后吸去高脂培養(yǎng)基，對(duì)應(yīng)含藥血清的不同分組分別加入高劑量濃度芪茵顆粒含藥血清、中劑量濃度芪茵顆粒含藥血清、低劑量濃度芪茵顆粒含藥血清、硫普羅寧含藥血清，模型組加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，空白組加入含10%的空白組含藥血清，干預(yù)24 h后，依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 分組后NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)游離脂肪酸(FFA)、人瘦素(LEP)、人抵抗素(RETN)濃度測(cè)定 將細(xì)胞以1×105密度接種于96孔板，取細(xì)胞上清液共接種3板，據(jù)“1.5.1”項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)方法分組并干預(yù)后，分別依據(jù)FFA試劑盒、LEP酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA Kit)試劑盒及RETN酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA Kit)試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度及時(shí)間點(diǎn)的的游離脂肪酸對(duì)L02細(xì)胞的誘導(dǎo)作用FFA的誘導(dǎo)作用隨著濃度及時(shí)間的增加而增加，當(dāng)FFA的作用濃度為1 mmol/L,作用時(shí)間為24 h時(shí)，F(xiàn)FA的作用效果最接近50%抑制率(IC50值)，故用FFA誘導(dǎo)L02細(xì)胞造NAFLD細(xì)胞模型的最佳條件為以1 mmol/L的濃度作用24 h，見表1。

表1 不同濃度及時(shí)間點(diǎn)FAA作用比較

2.2 經(jīng)不同濃度的游離脂肪酸誘導(dǎo)后的LO2細(xì)胞脂肪變性觀察以1、0.75、0.5、0.25 mmol/L 4個(gè)不同濃度的游離脂肪酸對(duì)LO2細(xì)胞誘導(dǎo)24 h后的染色結(jié)果進(jìn)行觀察，結(jié)果按照試劑盒說明書的操作。濃度為1 mmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的橙紅色脂滴最明顯，隨著濃度的降低染色后呈藍(lán)色的細(xì)胞核愈加明顯，見圖1。

1 mmol/L FFA(100×) 0.75 mmol/L FFA(100×) 0.5 mmol/L FFA(100×) 0.25 mmol/L FFA(100×)

圖1 油紅O染色結(jié)果

2.3 芪茵顆粒含藥血清對(duì)NAFLD細(xì)胞模型的抑制作用將細(xì)胞分為不同濃度的芪茵顆粒含藥血清組、模型組、空白組，干預(yù)12、24 h后，確定芪茵顆粒含藥血清的高、中、低劑量濃度，結(jié)果按照試劑盒說明書的操作。干預(yù)12 h后，含藥血清對(duì)NAFLD的抑制作用隨濃度上升而增加，干預(yù)24 h后，以含藥血清濃度為10%時(shí)，抑制率最接近50%為IC50值，見表2。

表2 不同濃度及時(shí)間點(diǎn)芪茵顆粒含藥血清的作用比較

濃度/%12 h波長(zhǎng)490 nm抑制率/%24 h波長(zhǎng)490 nm抑制率/%200.531±0.10132.70.375±0.04043.2150.585±0.15725.80.536±0.04861.7100.688±0.01812.80.425±0.04249.250.590±0.09225.20.562±0.18264.8模型組0.461±0.05741.60.336±0.03638.7正常對(duì)照組0.789±0.04800.868±0.1090

2.4 硫普羅寧含藥血清對(duì)NAFLD細(xì)胞模型的抑制作用將細(xì)胞分為不同濃度的硫普羅寧含藥血清組、模型組、空白組，干預(yù)12、24 h后，確定硫普羅寧含藥血清的IC50值，結(jié)果按照MTT試劑盒說明書的操作。干預(yù)24 h后10%硫普羅寧含藥血清抑制率最接近50%為IC50值，見表3。

表3 不同濃度及時(shí)間點(diǎn)硫普羅寧含藥血清的作用比較

濃度/%12 h波長(zhǎng)490 nm抑制率/%24 h波長(zhǎng)490 nm抑制率/%200.402±0.08545.90.374±0.02356.1150.568±0.03123.60.500±0.02641.3100.506±0.06032.00.389±0.03754.350.488±0.04634.50.492±0.04542.3模型組0.407±0.05345.30.444±0.02547.8正常對(duì)照組0.744±0.05800.852±0.1640

2.5 含藥血清對(duì)NAFLD細(xì)胞模型內(nèi)游離脂肪酸(FFA)、人瘦素(LEP)、人抵抗素(RETN)濃度的作用比較與空白組比較，模型組FFA濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，芪茵顆粒中劑量組、芪茵顆粒低劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組FFA濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組LEP濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，芪茵顆粒中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組LEP濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組RETN濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，芪茵顆粒中劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組RETN濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表4。

表4 NAFLD體外模型細(xì)胞中FFA、LEP、RETN濃度比較

組別FFALEPRETN芪茵顆粒高劑量組0.041±0.012178.613±129.065106.282±91.234芪茵顆粒中劑量組0.039±0.009▲177.182±77.582▲122.669±79.616▲芪茵顆粒低劑量組0.039±0.011▲239.658±191.194135.186±81.395陽(yáng)性對(duì)照組0.037±0.021▲146.308±74.897▲122.669±79.616▲模型組0.055±0.019?296.058±206.356?198.912±71.121?空白組0.032±0.01140.803±70.45582.840±60.883

注： 與空白組比較,*P<0.05, 與模型組比較,▲P<0.05。

3 討論

NAFLD在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)學(xué)中癥屬"肝癖"范疇,病位在肝、脾,久則可累及腎臟,病性多虛實(shí)夾雜,以濕、痰、瘀、毒為實(shí)為標(biāo),以肝失疏泄、脾失健運(yùn)、腎失固藏為虛為本[3]。本研究中的自擬經(jīng)驗(yàn)方芪茵顆粒以中醫(yī)藥整體觀念和中藥多層次、多途徑、多靶點(diǎn)的藥理作用為出發(fā)點(diǎn)，方中以生黃芪、茵陳為君，益脾胃、清肝熱祛濕濁；以決明子、三七粉為臣，瀉濁祛濕，濕瘀同治；生大黃、澤瀉、生山楂、補(bǔ)骨脂為佐，活血祛瘀兼補(bǔ)腎；以苦丁茶為使藥，清熱解毒、健脾消積。共奏抑肝扶脾、消導(dǎo)祛濕兼活血消積的功效。方中配伍體現(xiàn)了“虛濕瘀滯并治，肝脾腎同調(diào)，從虛論治”的特點(diǎn)，遵循 “健脾不如補(bǔ)腎”的思想，運(yùn)用臟腑虛損理論，著重調(diào)節(jié)腎之氣化、脾之運(yùn)化、肝之舒化，虛實(shí)兼治。

在近年來的國(guó)外研究中，NAFLD所導(dǎo)致的肝功酶學(xué)異常已成為多種慢性肝病的最常見誘因之一，同時(shí)也是引起肝硬化的主要前期病變之一[4-5]。其巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和較差的藥物療效，使經(jīng)濟(jì)有效的治療方法成為全球公共衛(wèi)生問題，在我國(guó)NAFLD的危害也日趨嚴(yán)重，成人發(fā)病率已達(dá)到15%，成為最常見的慢性肝病之一[6-7]。胰島素抵抗(IR)作為NAFLD 的關(guān)鍵發(fā)生環(huán)節(jié)之一，可以直接或間接促進(jìn)肝臟內(nèi)脂肪的沉積及肝損傷，進(jìn)而發(fā)生纖維化等終末期病變。一些與IR相關(guān)的蛋白或細(xì)胞因子，參與IR的形成過程。相關(guān)研究已證實(shí)IR與NAFLD的發(fā)病關(guān)聯(lián)密切，當(dāng)IR發(fā)生時(shí)，血清中FFA含量增加，迫使肝細(xì)胞內(nèi)FFA加速積累，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪變性，導(dǎo)致了NAFLD的發(fā)生[8-9]。抵抗素(RETN)通過影響肝臟的葡萄糖及脂質(zhì)代謝，使得周圍組織對(duì)胰島素的敏感性降低，促使細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生，加快了NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)抵抗素對(duì)糖脂代謝的影響，妨礙了其對(duì)機(jī)體正常的能量調(diào)節(jié)，引起IR的發(fā)生[10-12]。大多數(shù)肥胖患者存在瘦素(LEP)抵抗，瘦素抵抗通過影響肝臟脂肪代謝，引起高胰島素血癥和(或) 肝內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變，使外周脂肪分解產(chǎn)生大量FFA，加重IR[13-15]。本研究從與IR有關(guān)的因素(FFA、LEP、RETN)作為切入點(diǎn)，研究芪茵顆粒對(duì)NAFLD體外模型中IR的作用，結(jié)果表明芪茵顆?？梢燥@著抑制NAFLD體外模型中LEP及RETN的含量，降低單純性脂肪肝細(xì)胞中FFA的濃度，改善IR對(duì)NAFLD的影響，對(duì)NAFLD起到良好的治療作用。