張 玲， 蘆顏美， 周賢惠， 李耀東， 邢 強(qiáng)， 張疆華， 湯寶鵬

(新疆醫(yī)科大學(xué)1臨床醫(yī)學(xué)研究院科研基地科， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院心臟起搏電生理科， 烏魯木齊 830054)

心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)是臨床最常見的持續(xù)性心律失常之一，發(fā)病率隨著年齡增加而增加，給人民生活質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)[1-3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)起源于左房的房顫較右房的更多[4-5]，Embi等[6]研究結(jié)果顯示羊心右心耳和左心耳糖原的密度和分布不同，左耳較右耳有更多的糖原分布。以上研究為左房較右房更容易發(fā)生房顫提供了組織學(xué)基礎(chǔ)。

房顫時(shí)發(fā)生結(jié)構(gòu)重構(gòu)的表現(xiàn)為細(xì)胞間質(zhì)纖維化，致心肌收縮性減弱并心臟體積增大[7]。但在房顫從急性至慢性進(jìn)展過程中的膠原纖維及糖原沉積變化尚不清楚。本課題組之前的研究報(bào)道了48 h及8周左心耳起搏慢性房顫模型左右心耳在48 h及8 周房顫的膠原纖維及糖原的變化情況[8]，但未有HE染色、左、右心房及超微結(jié)構(gòu)變化的報(bào)道。本研究通過右心房快速起搏48 h及8 周建立犬房顫模型，通過HE染色、糖原染色及馬松(Masson)染色觀察犬在房顫進(jìn)展過程中大體結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)的變化及糖原和膠原纖維的變化，為房顫的結(jié)構(gòu)重構(gòu)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取成年比格犬18只，雌雄不限，體質(zhì)量 (12±2.23) kg，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。通過Lead 7000電生理儀持續(xù)監(jiān)測(cè)和記錄。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施均通過了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及房顫模型的制作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用隨機(jī)數(shù)字表法被隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(control組)，6只，犬植入起搏器不起搏；起搏48 h組(48 h AF 組)，6只，犬經(jīng)頸靜脈穿刺，通過7 F鞘管送入10極電極至高位右心房，以600次/min起搏，2倍的閾值電壓刺激高右房，待心電監(jiān)測(cè)出現(xiàn)房顫心電圖后開始持續(xù)起搏48 h。起搏8 周組(8 w AF 組)，6只，犬右側(cè)開胸，暴露心臟并心包吊籃，雙極電極縫于右心耳，縫合關(guān)閉心包。電極連于起搏器電極發(fā)生器。起搏器縫于右側(cè)胸肌囊袋內(nèi)。1周恢復(fù)后，起搏器打開并發(fā)放刺激，頻率為600 次/min。心電圖記錄出現(xiàn)房顫圖像后，持續(xù)起搏8周[9-10]。

1.3 組織學(xué)收集和處理造模結(jié)束后給予高劑量的戊巴比妥納實(shí)行安樂死，取出心臟。將左、右心房組織固定于4%多聚甲醛，石蠟包埋。組織均根據(jù)染色的標(biāo)準(zhǔn)過程進(jìn)行HE染色，糖原和Masson染色。電鏡標(biāo)本的留取，安樂死后即刻取左右心房組織切成1 mm3大小，4%戊二醛固定2 h，1/15 moL磷酸鹽緩沖液漂洗，1%四氧化餓固定，丙酮脫水。丙酮浸透1 h后包埋并超薄切片，醋酸鈾染色15～30 min，后透射電鏡觀察和采圖[8-9,11]。

1.4 組織影像的形態(tài)學(xué)分析染色的切片通過連接于倒置顯微鏡(Carl Zeiss，German)上的CCD攝像機(jī)捕捉，并用Axio Vision software(Axio Vision 4.1 Zeiss. German)軟件進(jìn)行分析。所有切片采樣均在同樣的采樣下進(jìn)行。糖原染色陽(yáng)性細(xì)胞的測(cè)定和膠原陽(yáng)性纖維的測(cè)定分別采取20×倍和 40×倍放大。糖原染色陽(yáng)性區(qū)域和膠原纖維的量化測(cè)量采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics，Inc.)。糖原和纖維的測(cè)量采用染色區(qū)域/ 圖形的總面積[8-9,11]。

2 結(jié)果

2.1 模型制作完成情況急性及慢性房顫模型的制作方法均參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行模型制作方法。18只犬均順利完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。實(shí)驗(yàn)過程中，血壓心率平穩(wěn)，無(wú)心衰現(xiàn)象發(fā)生。所有模型房顫成功率100%。

2.2 房顫模型心電圖檢測(cè)所有實(shí)驗(yàn)犬基礎(chǔ)狀態(tài)體表心電圖均呈竇性心律，control 組于8周內(nèi)每周行心電圖觀察均為竇性心律，48 h AF組起搏后即刻便為房顫心律，持續(xù)心電監(jiān)測(cè)均為房顫心律。8 w AF組起搏器開啟后數(shù)小時(shí)變?yōu)榉款澬穆桑?周內(nèi)每周行心電圖觀察起搏器工作狀態(tài)下均為房顫心律。

2.3 組織學(xué)研究

2.3.1 HE染色的比較 control組犬左心房組織切片HE染色可見心房肌細(xì)胞排列整齊，核清晰，周圍僅有少量間質(zhì)。48 h AF組HE染色較control組無(wú)明顯變化。8 w AF組犬左心房組織切片上HE染色可見心房肌細(xì)胞核大小不規(guī)則清晰度明顯降低，心肌纖維排列明顯紊亂，核異型明顯，細(xì)胞內(nèi)可見肌纖維斷裂；結(jié)締組織增生，心肌細(xì)胞間隔明顯增寬，見圖1。

control 組 48 h AF 組 8 w AF 組

圖1 3組左心房HE染色(×100)

2.3.2 糖原染色的比較 圖2顯示了control組、48 h AF組、8 w AF 組左心房(LA) 和右心房(RA)糖原分布的比較。糖原染色結(jié)果顯示，control組LA和RA心肌細(xì)胞僅有少量糖原聚集，48 h AF組心肌細(xì)胞糖原染色陽(yáng)性物質(zhì)較control組增多,LA多于RA，8 w AF 組胞漿內(nèi)糖原顆粒明顯增多形成糖原湖，LA較RA更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 馬松染色 膠原纖維的分布通過馬松染色來(lái)判斷。圖3顯示了control 組、48 h AF組、8 w AF 組 LA和RA膠原沉積的比較。Masson染色結(jié)果顯示，心肌纖維為紅色，膠原纖維為藍(lán)綠色，control 組犬心肌有少量膠原均勻分布于肌纖維之間。48 h AF組膠原纖維輕度增多,8 w AF組心肌細(xì)胞排列紊亂，膠原纖維大量分布于肌纖維之間且相互連接成網(wǎng)狀，排列紊亂，分布不均勻，LA較RA更明顯，8 w AF 組纖維化程度較48 h AF組更重。

2.4 電鏡結(jié)果的分析control 組肌原纖維細(xì)胞排列整齊緊密，心肌細(xì)胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)線粒體大小均一分布，膜完整，脊清楚，閏盤結(jié)構(gòu)完整，胞漿豐富，見圖4a。48 h AF 組心肌細(xì)胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，肌纖維間質(zhì)增寬，間質(zhì)部線粒體聚集，見圖4b。8 w AF 組線粒體腫脹變長(zhǎng)，體積增大，基質(zhì)變淡。肌原纖維排列紊亂，肌節(jié)長(zhǎng)短不一；糖原聚集，峭異形明顯，心肌閏盤不連續(xù)，扭曲，見圖4c、4d。

a: control組肌原纖維細(xì)胞排列整齊緊密，心肌細(xì)胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，胞漿內(nèi)線粒體大小均一分布，膜完整，脊清楚，閏盤結(jié)構(gòu)完整，胞漿豐富。 b: 48 h AF 組心肌細(xì)胞核膜完整，核仁清晰，核質(zhì)分布均勻，肌纖維間質(zhì)增寬，間質(zhì)部線粒體聚集。

c: 8 w AF組心肌細(xì)胞間線粒體變長(zhǎng)，增多線粒體腫脹，體積增大，基質(zhì)變淡。

d: 8 w AF組肌原纖維排列紊亂，肌節(jié)長(zhǎng)短不一；糖原聚集，細(xì)胞器數(shù)量增多，峭異形明顯，心肌閏盤不連續(xù)，扭曲。

圖4 control組、48 h AF組、8 w AF組心肌細(xì)胞馬松染色電鏡觀察

3 討論

通過持續(xù)快速心房起搏構(gòu)建房顫模型是目前最常用的建立房顫模型的方法[10-11]。人和動(dòng)物研究均發(fā)現(xiàn)，LA起源的房顫更常見，左、右心房的結(jié)構(gòu)特征、蛋白表達(dá)均有不同。由于左、右心房的解剖等特性，使LA更易發(fā)生房顫[12-13]。先前的研究也發(fā)現(xiàn)，在基線狀態(tài)左心耳較右心耳有更多的糖原聚集，通過左心耳起搏建立AF模型后48 h及8 周均出現(xiàn)了LA的糖原聚集比RA更明顯的現(xiàn)象，且8 周糖原聚集程度較48 h更重，LA的糖原分布可從閏盤延伸到心肌細(xì)胞[9]，這些發(fā)現(xiàn)表明這些部位的糖原聚集可能在橫向和縱向方向阻礙了心肌細(xì)胞間的電傳導(dǎo)，這些異質(zhì)性分布的阻礙傳導(dǎo)的糖原島使得非單一激動(dòng)波陣形成緩慢的傳導(dǎo)異向性，而由于左側(cè)糖原分布更多使得LA來(lái)源的房顫較RA更容易發(fā)生。在本研究中，在基線狀態(tài)，即使使用右心房起搏，LA的糖原累積仍較RA明顯。提示無(wú)論LA起源或RA起源的房顫，均可造成LA的糖原累積程度較右側(cè)重。無(wú)論在基線還是AF的進(jìn)展階段，LA及RA的糖原濃度和分布的不同可能促進(jìn)了房顫發(fā)生。

房顫及其伴隨的心血管疾病常?？赡苷T發(fā)心房肌在組織學(xué)水平及超微結(jié)構(gòu)不同程度的變化。房顫的病史越長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)重構(gòu)的程度越重。房顫是一種伴隨著心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)的心律失常，房顫既是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的結(jié)果，隨著房顫的發(fā)展也可促進(jìn)心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的進(jìn)展。因此一旦發(fā)生了結(jié)構(gòu)重構(gòu)，即使恢復(fù)為竇性心律，也僅有非常少的結(jié)構(gòu)重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)。而心肌細(xì)胞之間的膠原沉積是房顫啟動(dòng)的重要因素，也是房顫導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的最主要的變化。纖維化是房顫的重要基質(zhì)及電生理傳導(dǎo)阻滯的重要原因，表現(xiàn)為橫向及縱向的雙向阻滯，從而造成了分割的波陣從而促進(jìn)了折返的形成[14-15]。本研究結(jié)果顯示,糖原聚集和其他因素，神經(jīng)和電生理的變化，為陣發(fā)性房顫提供了基質(zhì)的同時(shí)，起搏8周誘發(fā)的房顫膠原纖維明顯增加為AF的維持提供了基質(zhì)。已有的研究證據(jù)也顯示糖原累積和纖維化是房顫形成的長(zhǎng)期持續(xù)性的形式[16-17]。

超微結(jié)構(gòu)方面，從透射電鏡可以看出房顫48 h后僅出現(xiàn)心肌細(xì)胞間線粒體聚集心肌能量代謝異常，8 周后可見心肌細(xì)胞肌原纖維排列紊亂，心肌閏盤不連續(xù)，肌節(jié)長(zhǎng)短不一。線粒體變長(zhǎng)，基質(zhì)變淡,線粒體脊變短、異形。并出現(xiàn)糖原聚集。隨著房顫從陣發(fā)性變?yōu)槌掷m(xù)性，結(jié)構(gòu)重構(gòu)使得無(wú)論經(jīng)典抗心律失常藥物還是單純肺靜脈隔離的房顫治療都無(wú)效[18-19]。因此，房顫的治療中至關(guān)重要的是在房顫發(fā)生的早期預(yù)防心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)、纖維化、糖原聚集及超微結(jié)構(gòu)的改變。