宋丹琳,鄭靜,孔健,李明偉,王洋,張海

結(jié)腸癌是臨床常見惡性腫瘤，GLOBOCAN估計我國男性、女性的結(jié)直腸癌發(fā)病率分別為16.9/10萬、11.6/10萬，死亡率分別為9.0/10萬、6.1/10萬[1]。遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌高死亡率的主要原因之一[2]，腫瘤細(xì)胞的遠處轉(zhuǎn)移涉及侵襲及遷移能力的改變[3]，且與細(xì)胞骨架的形態(tài)分布密切相關(guān)[4]。近年報道顯示超聲輻照技術(shù)能夠提高結(jié)腸癌藥物治療效果[5]，但針對性分析超聲輻照技術(shù)對結(jié)腸癌細(xì)胞骨架及侵襲、遷移能力影響的報道較少，本研究以結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞為對象，擬重點探討高機械指數(shù)超聲輻照微泡對結(jié)腸癌細(xì)胞骨架及侵襲、遷移能力的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

實驗材料：結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株，購自中科院上海生命科學(xué)研究院。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基，購自美國Gibco；胎牛血清，購自杭州四季青；Hank液及胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)，購自美國Sigma；聲諾維造影劑，購自意大利Bracco；mytomycin C，購自美國selleck；Transwell小室，購自美國BD。主要儀器：Vivid 5型彩色多普勒超聲儀，購自美國GE；TCS-SP5激光共聚焦顯微鏡，購自德國Leica；BV51熒光顯微鏡，購自日本Olympas。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出Lovo細(xì)胞，復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度。隔天傳代1次，達到對數(shù)生長期后，用0.25%胰蛋白酶消化，制備為2×105個/mL單細(xì)胞懸液。

1.2.2 分組方法 擬將細(xì)胞分為空白對照組、超聲輻照組、微泡組及超聲輻照+微泡組，開展對照研究。

1.2.3 細(xì)胞遷移能力檢測 以每孔5×105/個細(xì)胞的密度，將Lovo細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后加入S期細(xì)胞周期阻滯劑mytomycin C，預(yù)處理1 h以抑制細(xì)胞生長。以10 μL移液槍頭在每個培養(yǎng)孔內(nèi)劃一條直線，PBS洗去劃下的細(xì)胞，隨后加入無血清DMEM培養(yǎng)基(空白對照組及超聲輻照組)或50 μL/mL聲諾維含藥無血清DEME培養(yǎng)基(超聲輻照+微泡組及微泡組)，每組3孔。需要超聲輻照的兩組，調(diào)節(jié)超聲探頭頻率為1.5 MHz，機械指數(shù)1.7，顯像深度4 cm，用醫(yī)用膠帶將探頭環(huán)形纏繞，呈現(xiàn)一凹槽，在凹槽中加入耦合劑，使培養(yǎng)板與耦合劑充分接觸，超聲輻照6 s，間歇6 s，共20次。繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察24 h各組細(xì)胞劃痕愈合情況，以Image-Pro Plus 6.0計算劃痕愈合率。

1.2.4 細(xì)胞侵襲能力檢測 在24孔板中加入600 μL含20%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)孔中按分組要求加入無血清DMEM培養(yǎng)基(空白對照組及超聲輻照組)或50 μL/mL聲諾維含藥無血清DEME培養(yǎng)基(超聲輻照+微泡組及微泡組)，每組3孔，然后將250 μL細(xì)胞懸液加入至Transwell小室中。需要超聲輻照的兩組參考細(xì)胞遷移能力檢測部分進行超聲輻照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以棉簽拭去小室內(nèi)底部未遷移的細(xì)胞，4%甲醛固定小室外底部的細(xì)胞，染色后，觀察各組細(xì)胞穿過小室的細(xì)胞數(shù)目，取5個高倍鏡視野細(xì)胞數(shù)的均值。

1.2.5 細(xì)胞骨架形態(tài)檢測 在細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)時，參考細(xì)胞遷移能力檢測部分進行相關(guān)分組處理，待達到對數(shù)生長期后，用PBS漂洗，0.25%胰酶消化，制備為1×105個/mL單細(xì)胞懸液，以每孔2×105/個細(xì)胞的密度加入預(yù)先加有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組6孔，其中3孔用于檢測細(xì)胞微絲，3孔用于檢測細(xì)胞微管，24～48 h后，取出細(xì)胞爬片。用于細(xì)胞微管檢測的爬片，PBS洗2～3次，2%多聚甲醛固定20 min，再以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；隨后加入山羊血清，封閉30 min，再以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；隨后加入鼠抗人β-tubulin單克隆抗體為一抗，37 ℃下孵育90 min，在以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；添加FITC標(biāo)記的二抗，室溫孵育90 min，再以PBS洗3次，每次5 min；最后以緩沖甘油封片，鏡下觀察。用于細(xì)胞微絲觀察的爬片，1×PBS漂洗3次，每次5 min，2%多聚甲醛固定20 min，再以PBS洗3次，每次5 min；再以0.5% Triton X-100+PBS洗3次，每次5 min；隨后將爬片置于濕盒內(nèi)，加入5 μg/mL FITC-phallodin，37 ℃孵育30 min，PBS洗4次，每次5 min；最后以緩沖甘油封片，鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四組細(xì)胞遷移及侵襲能力對比

細(xì)胞劃痕實驗顯示超聲輻照+微泡組劃痕愈合率明顯低于其它三組(P<0.05)，超聲輻照組、微泡組及空白對照組劃痕愈合率對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Transwell細(xì)胞侵襲實驗顯示超聲輻照+微泡組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯低于其它三組(P<0.05)，超聲輻照組、微泡組及空白對照組細(xì)胞侵襲數(shù)目對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 四組細(xì)胞遷移及侵襲能力對比

注：*與超聲輻照+微泡組對比，P< 0.05

圖1 四組細(xì)胞劃痕愈合結(jié)果 ①超聲輻照+微泡組；②超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

圖2四組細(xì)胞Tranwell侵襲實驗結(jié)果 ①超聲輻照+微泡組；②超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

2.2 四組細(xì)胞微管、微絲結(jié)構(gòu)對比

超聲輻照組、微泡組、空白對照組微管染色表現(xiàn)均呈細(xì)胞致密的絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，放射性延伸至細(xì)胞邊緣；超聲輻照+微泡組絲狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)稀疏，主要沿細(xì)胞長軸排列，見圖3；超聲輻照組、微泡組、空白對照組微絲染色均呈細(xì)胞致密網(wǎng)絡(luò)狀細(xì)絲結(jié)構(gòu)，向四周伸出大量短小的毛刺狀突起，呈拉絲狀，有明顯的方向型；超聲輻照+微泡組細(xì)胞質(zhì)中部細(xì)絲明顯減少，熒光暗淡，未構(gòu)成明顯的網(wǎng)絡(luò)狀，周邊毛刺狀突起減少，見圖4。

圖3 四組細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)對比 ①：超聲輻照+微泡組；②：超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

圖4 四組細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)對比 ①：超聲輻照+微泡組；②：超聲輻照組；③微泡組；④空白對照組

3 討論

侵襲和遷移是結(jié)腸癌威脅患者生命安全的主要原因，多數(shù)結(jié)腸癌患者在確診時已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，即便早期結(jié)腸癌患者能夠及時接受手術(shù)治療，其中大部分仍死于遠處轉(zhuǎn)移[6-7]。抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，對提升患者預(yù)后有一定價值[8-9]。

細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)與細(xì)胞侵襲和遷移密切相關(guān)，細(xì)胞骨架主要由微管、微絲及中間纖維構(gòu)成[10-11]。其中微絲主要由肌動蛋白構(gòu)成，在細(xì)胞的變形運動中起關(guān)鍵作用[12]：微絲纖維生長，使細(xì)胞表面突出，形成片足，并在片組與基質(zhì)接觸的位置形成粘著斑，隨后在肌動蛋白的作用下微絲纖維滑動，使細(xì)胞主體前移，同時解除細(xì)胞后方的粘著點，循環(huán)往復(fù)，使細(xì)胞向前移動；微管不僅對維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分裂、信號傳導(dǎo)及物質(zhì)輸送中有重要作用，且在腫瘤細(xì)胞分裂過程中存在微管動力學(xué)改變現(xiàn)象，同時微管動力學(xué)改變與染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)[13]?？梢姡⒐芗拔⒔z形態(tài)與腫瘤侵襲及遷移能力密切相關(guān)。

本研究顯示空白對照組Lovo細(xì)胞中微管及微絲均存在聚集、重排現(xiàn)象，微絲向四周伸出大量短小的毛刺狀突起，有利于其運動與侵襲，與既往研究[14-15]結(jié)論一致。而本研究發(fā)現(xiàn)高機械指數(shù)超聲輻照微泡能夠降低微管和微絲表達輕度，使微管主要沿細(xì)胞長軸排列，并減少微絲的毛刺狀突起，這說明超聲輻照微泡能夠改變微管的組裝與分布，影響肌動蛋白應(yīng)力纖維束的形成及粘著斑的合成與分布，從而改變Lovo細(xì)胞的侵襲和遷移能力，與鐘華等[16]觀察結(jié)果類似，楊名珍等[17]針對肺癌的研究也提示超聲輻照能夠改變腫瘤細(xì)胞的骨架。超聲輻照對腫瘤骨架的影響，主要得益于其空化效應(yīng)[18-19]：微泡在超聲場的作用下，振動、生長并不斷聚集聲場能量，當(dāng)能量超過某個閾值時，微泡急劇崩潰閉合，產(chǎn)生沖擊破，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)。

本研究通過細(xì)胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗直接觀察四組細(xì)胞的遷移及侵襲能力，顯示超聲輻照+微泡組細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯下降，而單純應(yīng)用超聲輻照或微泡，不會發(fā)生上述改變，與針對前列腺癌細(xì)胞PC-3的研究[20]結(jié)論相似，提示超聲輻照微泡形成的空化效應(yīng)能夠抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，其機制可能主要與超聲輻照微泡對腫瘤骨架的影響有關(guān)，這為結(jié)腸癌的靶向性治療提供了一定參考，即可能通過局部高機械指數(shù)超聲輻照微泡強化結(jié)腸癌的治療效果，但尚需臨床研究證實。

綜上，高機械指數(shù)超聲輻照微泡能夠抑制結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的侵襲及遷移能力，這可能與其能夠破壞Lovo細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有關(guān)。