蔡曉軍 孫楊贏 潘道東，2* 曹錦軒 曾小群 吳 振 楊雪松

（1 寧波大學(xué)浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點實驗室 浙江寧波315211 2 南京師范大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)系 南京210097）

沙門氏菌（Salmonella）是一種常見的食源性致病菌，在畜禽腸道帶菌率較高，常引起肉類食品的污染，這是造成人類沙門氏菌病的重要原因之一。人類感染沙門氏菌會出現(xiàn)脫水，嘔吐、腹瀉等胃腸炎癥狀，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡。合理使用抗菌劑，降低畜禽原料肉沙門氏菌的帶菌率是控制食源性疾病爆發(fā)的一種常見手段[1-3]。目前，畜禽生產(chǎn)中常用抗菌劑主要有化學(xué)抗菌劑和天然抗菌劑，前者使用過多易造成細(xì)菌的耐藥性，甚至威脅人類的健康。天然抗菌劑以其優(yōu)質(zhì)、安全、高效的特點備受關(guān)注[4]。香料植物作為天然抗菌劑精油的重要來源，在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用較多[5]。

迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）是唇形科迷迭香屬香料植物，含有多種具有抗菌、抗氧化、抗癌、鎮(zhèn)痛消炎等功效的活性物質(zhì)[6]，在食品、制藥和醫(yī)學(xué)保健等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。迷迭香提取物及其精油的抑菌性主要與酚酸類成分及萜烯類成分有關(guān)[6]，其中，酚酸類成分以鼠尾草酸和迷迭香酸含量較高，而萜烯類成分則以1，8-桉葉素、樟腦及α-蒎烯最為常見[7-9]。研究表明，迷迭香酸[10]和鼠尾草酸[11]均有廣譜抑菌性，后者對大腸桿菌、綠膿桿菌及肺炎克雷伯氏菌等表現(xiàn)出與氯霉素效果相當(dāng)甚至更優(yōu)異的抗菌活性。1，8-桉葉素、樟腦、α-蒎烯、月桂烯[12]、β-石竹烯等[13]萜類成分對大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等多種致病菌均有較強的抑菌性。目前國內(nèi)外學(xué)者對迷迭香單體成分的報道多集中于生物活性研究及相關(guān)應(yīng)用上，而關(guān)于抑菌機理的報道較為少見。

本研究擬采用牛津杯法比較迷迭香中含量較高的6 種單體組分[6]——鼠尾草酸、1，8-桉葉素、樟腦、α-蒎烯、β-石竹烯和冰片（龍腦）對沙門氏菌的抑菌作用，找出最強抑菌組分，結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜損傷以及相關(guān)酶活力確定其抑菌機理，為控制沙門氏菌源食源性疾病的爆發(fā)以及迷迭香成分的開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種與培養(yǎng)基

沙門氏菌（Salmonella）為寧波大學(xué)實驗室保藏菌種。營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基，購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 材料及試劑

鼠尾草酸（60%，HPLC），上海源葉生物科技有限公司；1，8-桉葉素（99%）、（+）-冰片 （龍腦，98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；（±）-樟腦（96%）、β-石竹烯（90%，來源于樟樹），北京百靈威科技有限公司；α-蒎烯（≥98%，GC），北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PBS 緩沖液 （干粉，1 L 含0.01 mol/L PO43+、0.8% NaCl，pH 7.2～7.4），北京酷來搏科技有限公司；堿式磷酸酶（AKP）測試盒、鉀（K）測試盒，南京建成生物工程研究所；GENMED正苯基萘胺攝入法細(xì)菌膜損傷熒光檢測試劑盒、GENMED 半乳糖苷酶釋放法細(xì)菌膜損傷熒光檢測試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

電子數(shù)顯卡尺0～150 mm，桂林廣陸數(shù)字測控股份有限公司；LDZH-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療機械廠；SW-CJ-2F 超凈工作臺，蘇州華科凈化設(shè)備有限公司；HWS-0288 智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器制造廠；H2500R-2 高速冷凍離心機、H-2050R 高速冷凍離心機，長沙湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；Eppendorf centrifuge 5418R，艾本德中國有限公司；Infinnite200pro 酶標(biāo)儀，瑞士TECAN 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 迷迭香單體組分溶液的配制 選擇迷迭香6 種單體組分鼠尾草酸、1，8-桉葉素、 樟腦、α-蒎烯、β-石竹烯和冰片（龍腦）[6]。采用95%的乙醇溶液分別將6 種組分配成質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的溶液，用直徑0.22 μm 的無菌過濾器過濾除菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌懸液的制備及含菌平板的制備 活化后的沙門氏菌按照3%的比例接種至100 mL 肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)18 h，以滅菌肉湯為溶劑，將菌液稀釋至105～106CFU/mL。向無菌培養(yǎng)皿中倒入20 mL 滅菌的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后分別加入0.1 mL 菌液（105～106CFU/mL），涂布均勻制成含菌平板備用。

1.4.3 迷迭香組分的抑菌活性 采用牛津杯法測定抑菌直徑，參照Diao 等[14]的方法并作適當(dāng)修改。瓊脂平板表面以間距2～3 cm 放置2 個無菌干燥牛津杯（外徑8 mm，內(nèi)徑6 mm，高10 mm）并輕輕按壓。向牛津杯中分別加入6 種質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的迷迭香單體組分溶液各0.2 mL，用等體積95%乙醇溶液及生理鹽水作對照。平板于4 ℃放置1 h 后平放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌直徑，重復(fù)3 次。

1.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對1，8-桉葉素溶液抑制率的影響 以1，8-桉葉素為抑菌劑，預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)低于10%，1，8-桉葉素不能溶解完全，過高則會表現(xiàn)抑菌作用，需篩選合適的溶劑濃度進行后期試驗。采用10%，20%，30%，40%和50%的乙醇肉湯溶液分別配制10 mg/mL 的1，8-桉葉素溶液，用肉湯倍比稀釋至5，2.5 mg/mL，以相應(yīng)濃度乙醇肉湯溶液作溶劑對照。向10 mL 無菌離心管中按體積比1∶1 分別加入105～106CFU/mL 菌懸液和0，2.5，5，10 mg/mL 1，8-桉葉素溶液混勻，管內(nèi)實際含1，8-桉葉素質(zhì)量濃度分別為0，1.25，2.5，5 mg/mL，設(shè)置2 種對照組：以無菌肉湯和相應(yīng)濃度無菌乙醇肉湯溶液分別作陽性對照和陰性對照?；靹蛑糜?7 ℃、150 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，測定各組樣品600 nm 處OD 值并按公式（1）計算抑制率[15]，重復(fù)測定3 次。

1.4.5 1，8-桉葉素對沙門氏菌的最小抑菌濃度（MIC）及細(xì)菌生長曲線 取37 ℃培養(yǎng)12 h 的沙門氏菌按照一定比例加入到新的肉湯培養(yǎng)基中，調(diào)整菌密度約為107CFU/mL。最小抑菌濃度（MIC）測定[16]。用10%乙醇水溶液配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的1，8-桉葉素儲備液，采用二倍稀釋法稀釋至5，2.5，1.25，0.625，0.3125 mg/mL。將藥液與菌液等比例混勻，置于37 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，用生理鹽水作空白對照。以肉眼觀察菌液澄清的最低含藥量為MIC 值，重復(fù)測定3 次。

沙門氏菌生長曲線繪制[17]。用10%乙醇肉湯溶液配制質(zhì)量濃度10 mg/mL 的儲備液，用肉湯稀釋適當(dāng)比例后加入到菌液中配成含藥終濃度分別為1 MIC 和2 MIC 的1，8-桉葉素溶液，用不含藥物的菌懸液作對照組。37 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h 分別取樣測定OD600nm值，以取樣時間為橫坐標(biāo)、以O(shè)D600nm值為縱坐標(biāo)繪制沙門氏菌生長曲線，重復(fù)測定4 次。

1.4.6 對細(xì)菌細(xì)胞壁通透性及鉀離子泄漏的影響 細(xì)胞壁通透性測定參照Xu 等[18]的方法并做適當(dāng)修改。取37 ℃培養(yǎng)12 h 的沙門氏菌于5 000 r/min 離心10 min 去上清，沉淀用無菌水洗滌3次后重懸至107CFU/mL。用10%乙醇水溶液配制10 mg/mL 的1，8-桉葉素儲備液，無菌水稀釋適當(dāng)比例后加入到菌懸液中配成含藥物終濃度分別為1MIC、2MIC 的1，8-桉葉素溶液，同時以不含藥物的菌液為對照組。樣品置于37 ℃、150 r/min 條件恒溫振蕩培養(yǎng)，取培養(yǎng)3 h 的菌懸液各1 mL，3 500 r/min 離心10 min，吸取上清液用堿性磷酸酶（AKP）試劑盒測定不同樣品培養(yǎng)液的AKP 含量，重復(fù)測定3 次。

鉀離子含量測定：取上述試驗培養(yǎng)0，3 和6 h 的樣品各1 mL，3 500 r/min 離心10 min，取上清參照鉀（K）測試盒說明書測定鉀離子含量，結(jié)果按照說明書公式，即公式（2）進行計算，重復(fù)測定3次。

式中，x——樣本管絕對OD 值，即x=OD樣品－OD空白。

1.4.7 對細(xì)菌外膜損傷和內(nèi)膜損傷的影響 接種3%經(jīng)37 ℃培養(yǎng)12 h 的沙門氏菌菌液到50 mL 滅菌肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 條件繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.50±0.01。取1.4.7 節(jié)所制儲備液用無菌水倍比稀釋成1MIC、2MIC 的1，8-桉葉素溶液，同時以不含藥物的菌液作對照組。細(xì)菌外膜和內(nèi)膜損傷程度分別按照GENMED 正苯基萘胺攝入法和GENMED 半乳糖苷酶釋放法細(xì)菌膜損傷熒光檢測試劑盒說明書進行操作，結(jié)果以相對熒光單位（Relative Fluorescence Units）表示，重復(fù)測定3 次。

1.4.8 對細(xì)菌核酸物質(zhì)和可溶性蛋白泄漏的影響核酸物質(zhì)測定[17]：參照1.4.7 節(jié)制取沙門氏菌沉淀及1，8-桉葉素儲備液。沉淀用0.01 mol/L pH 7.4 的PBS 洗滌并重懸至107CFU/mL，儲備液用無菌水稀釋適當(dāng)比例后加入到菌懸液中配成含藥物終濃度分別為1MIC、2MIC 的1，8-桉葉素溶液，以不含藥物的菌液作對照組。37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)6 h，每隔1 h 分別取樣1 mL，5 000 r/min 離心10 min，測定上清液在260 nm 處的吸光值，重復(fù)測定3 次。

蛋白質(zhì)含量的測定：取上述試驗中培養(yǎng)2，4，6 h 的菌液各1 mL，5 000 r/min 離心10 min 后取上清液按照福林酚法于500 nm 處測定OD 值，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度，重復(fù)測定3 次。

1.4.9 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.0 軟件one-way ANOVA 過 程 中 的Duncan’s multiplerange test 檢驗過程進行差異性分析，通過Origin8.5 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 迷迭香成分對沙門氏菌的抑菌直徑

如表1所示，迷迭香6 種組分對沙門氏菌的抑菌直徑均明顯高于對照組，以1，8-桉葉素抑菌直徑最大。結(jié)果表明，迷迭香6 種組分以1，8-桉葉素對沙門氏菌抑菌作用最強。迷迭香提取物及精油具有廣譜抑菌性，其抑菌活性顯著高于常見的食品防腐劑二丁基羥基甲苯（BHT）和苯甲酸[19]，且對不同細(xì)菌的抑菌效果與酚酸類、 萜烯類成分的種類或含量有關(guān)[20-22]。1，8-桉葉素是迷迭香精油的主要組分，精油的抑菌作用表現(xiàn)為其主要組分的抑菌活性[22]。因此，選擇1，8-桉葉素為對象研究其對沙門氏菌的抑菌機理。

表1 迷迭香組分對沙門氏菌的抑菌直徑Table 1 Inhibition zone of Rosemary extract ingredients to Salmonella

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對1，8-桉葉素抑制率的影響

如圖1所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于10%，對照組（0 mg/mL）和1，8-桉葉素試驗組（5，2.5 mg/mL）的抑制率均接近于100%，不能排除乙醇的抑菌作用。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%時，與對照組相比，5 mg/mL 試驗組抑制率增加26.16%，乙醇抑菌作用相對降低。綜上所述，選取體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇溶液作為溶劑進行后期試驗。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對1，8-桉葉素抑制率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the inhabitation ratio of 1，8-cineol

2.3 1，8-桉葉素最小抑菌濃度（MIC）及對沙門氏菌生長曲線的影響

1，8-桉葉素的MIC 為2.5 mg/mL。如圖2所示，1MIC（2.5 mg/mL）和2MIC（5 mg/mL）2 個處理組的OD 值均呈先略微下降再趨于水平的趨勢，而對照組細(xì)菌持續(xù)增長，在14 h 時達(dá)到穩(wěn)定期。說明1，8-桉葉素在1MIC 和2MIC 兩種濃度下均能夠完全抑制沙門氏菌的生長甚至殺死細(xì)菌。Sokovic等人[12]發(fā)現(xiàn)，1，8-桉葉素對大腸埃希氏菌、沙門氏菌、 金黃色葡萄球菌等多種致病菌均有抑菌性，與本試驗結(jié)果相似。

圖2 1，8-桉葉素對沙門氏菌生長曲線的影響Fig.2 Antibacterial kinetics of 1，8-cineol against Salmonella

2.4 對細(xì)胞壁通透性的影響

細(xì)菌中培養(yǎng)液AKP 含量間接反映出細(xì)胞壁的通透性[15]。由表2可知，加入1，8-桉葉素溶液后，菌液堿式磷酸酶（AKP）活力明顯增加，且1，8-桉葉素濃度越高，酶活力越大。表明1，8-桉葉素破壞了沙門氏菌細(xì)胞壁，從而使菌液AKP 含量增加。脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特有組成成分，與革蘭氏陰性致病菌的病原能力有關(guān)[24]。Zhao等[25]發(fā)現(xiàn)1，8-桉葉素能夠降低由脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺炎癥。1，8-桉葉素對革蘭氏陰性菌的抑菌活性總體高于革蘭氏陽性菌[22]，可能是其與脂多糖相互作用的結(jié)果，致使細(xì)胞壁通透性受到破壞。

表2 1，8-桉葉素對沙門氏菌AKP 活力及細(xì)胞膜損傷的影響Table 2 The AKP activity and membrane damage of Salmonella treated with 1，8-cineol

2.5 對細(xì)菌外膜損傷和內(nèi)膜損傷的影響

如表2所示，添加1，8-桉葉素使沙門氏菌內(nèi)外膜的相對熒光強度顯著提高（P＜0.05），且隨著藥物濃度增加而增大。表明1，8-桉葉素對沙門氏菌的外膜和內(nèi)膜造成熒光損傷，且濃度越高，膜損傷程度越大。1，8-桉葉素通過誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜損傷作用發(fā)揮抗菌活性[22]。Anjos 等[26]在研究皮膚的滲透機制時發(fā)現(xiàn)，1，8-桉葉素分子內(nèi)部氫鍵的疏水作用能夠促進自身分子到達(dá)雙層膜的中心地帶，分子的極性基團在該區(qū)域通過吸引親水側(cè)的極性脂質(zhì)首基，破壞細(xì)胞膜極性接口處的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，從而促進膜分區(qū)，最終使分子透過膜結(jié)構(gòu)。這或許能夠解釋1，8-桉葉素對沙門氏菌外膜和內(nèi)膜的損傷機制。

2.6 對細(xì)菌鉀離子泄漏情況的影響

由圖3可知，與對照組相比，添加1，8-桉葉素使沙門氏菌K+發(fā)生泄漏，2MIC 處理組泄漏量顯著高于1MIC 處理組（P＜0.01），泄漏程度隨著作用時間的延長而有所增加。K+是微生物細(xì)胞內(nèi)的重要陽離子，參與細(xì)胞內(nèi)部多種生理功能和代謝途徑，其功能主要在于維持細(xì)胞膜的滲透壓和穩(wěn)定性等[27]。當(dāng)細(xì)菌受到藥物抑制時，細(xì)胞膜流動性和透性發(fā)生改變，造成胞內(nèi)K+等小分子物質(zhì)泄漏，影響細(xì)胞的功能特性甚至造成菌體死亡[28]。1，8-桉葉素能夠使沙門氏菌K+發(fā)生泄漏，表明細(xì)菌細(xì)胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變。

2.7 對細(xì)菌胞內(nèi)核酸物質(zhì)泄漏情況的影響

核酸物質(zhì)在260 nm 處有最強吸收峰，通過測定細(xì)菌培養(yǎng)液260 nm 處的吸光值可以判斷核酸物質(zhì)的泄漏情況[29]。由圖4可知，添加1，8-桉葉素溶液使培養(yǎng)液260 nm 處的吸光值明顯增加，且隨保鮮劑濃度的增加延長和作用時間延長顯著增大（P＜0.01），試驗組的吸光值明顯高于對照組，4 h達(dá)到最大值。藍(lán)蔚青等[15]發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合保鮮劑能夠破壞熒光假單胞菌細(xì)胞膜的完整性。Yao 等[29]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細(xì)胞膜受損能夠引起胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生泄漏。1，8-桉葉素能夠使沙門氏菌核酸物質(zhì)外滲，表明沙門氏菌細(xì)胞膜的完整性受到破壞。

2.8 對細(xì)菌蛋白質(zhì)泄漏情況的影響

圖3 1，8-桉葉素對沙門氏菌鉀離子泄漏的影響Fig.3 Effect of 1，8-cineol on the content of K+ released from Salmonella

圖4 1，8-桉葉素對沙門氏菌OD260nm 的影響Fig.4 Effect of 1，8-cineol on the OD260nm of Salmonella

圖5 1，8-桉葉素對沙門氏菌胞外蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.5 Effect of 1，8-cineol on extracellular protein concentration of Salmonella

如圖5所示，與對照組相比，添加1，8-桉葉素使沙門氏菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度增加，2MIC 處理組顯著高于1MIC 處理組（P＜0.01），作用時間越長，蛋白質(zhì)濃度越大。蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)重要組成成分，與細(xì)胞多種生理代謝活動有關(guān)，細(xì)胞膜受損傷可引起胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏[29]。本試驗中1，8-桉葉素使沙門氏菌蛋白質(zhì)發(fā)生泄漏，說明沙門氏菌細(xì)胞膜受到破壞，破壞程度隨著藥物濃度增加和作用延長而增大。

3 結(jié)論

迷迭香6 種主要組分對沙門氏菌均有較強的抑菌作用，以1，8-桉葉素最強。1，8-桉葉素溶液在濃度為1MIC 和2MIC 時對對數(shù)期的沙門氏菌抑制效果顯著，它能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，損傷細(xì)菌的外膜和內(nèi)膜，改變并破壞細(xì)胞膜的通透性和完整性，引起胞內(nèi)物質(zhì)（K+、核酸、蛋白質(zhì)）外滲。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷破壞程度及胞內(nèi)物質(zhì)的外滲程度隨著藥液劑量的增加和作用時間的延長而相應(yīng)增大。1，8-桉葉素抑制沙門氏菌的機理，主要是通過損傷細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而破壞胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性而起作用。