方 冰 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政*

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京100083 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 教育部北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100083）

在食品生產(chǎn)過程中加入相對廉價的原料是最常見的摻雜現(xiàn)象，這同樣存在于乳制品的生產(chǎn)過程中。一些價格相對低廉的動、植物蛋白常被添加到乳中作為乳蛋白替代物，這一現(xiàn)象在原料乳收購環(huán)節(jié)尤為明顯。鑒于此，乳品加工企業(yè)在原料乳收購環(huán)節(jié)進(jìn)行牛乳蛋白的摻假檢測十分重要。

目前牛乳蛋白摻假檢測的方法主要有聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法和毛細(xì)管電泳4 種。聚丙烯酰胺凝膠電泳主要是根據(jù)待測蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)的差異實(shí)現(xiàn)分離、鑒定，通常結(jié)合兩種鑒別原理，即利用二維電泳進(jìn)行水牛乳[1]、山羊乳和綿羊乳中蛋白的鑒別[2-3]。然而，蛋白質(zhì)分子在加工過程中容易發(fā)生水解以及糖基化、磷酸化等修飾變化，引起分子質(zhì)量及等電點(diǎn)的變化；此外，蛋白質(zhì)分子在電泳條帶中的分布，極易受到凝膠的濃度、緩沖液體系、凝膠遷移速度等條件的影響，而分子質(zhì)量的確證往往依賴于標(biāo)準(zhǔn)蛋白條帶的參照，使得該法主觀性較大；加上一些低峰度的蛋白質(zhì)較難檢出的限制，聚丙烯酰胺凝膠電泳法較難應(yīng)用。高效液相色譜法常用于乳蛋白組成的分離鑒定[4-8]，在摻假檢測方面亦有報道，如鑒別脫脂奶粉中摻加的植物蛋白（大豆蛋白和豌豆蛋白）[9]；用β-Lg 作為標(biāo)志物，檢測水牛奶及其干酪中摻加的牛奶[10]。然而，蛋白質(zhì)具有亞基結(jié)構(gòu)，立體構(gòu)型及構(gòu)象復(fù)雜，有可能發(fā)生有機(jī)流動相中蛋白質(zhì)的變性或被測組分的共洗脫現(xiàn)象，降低分離效率及鑒別能力[11]。此方法所需的色譜柱和色譜純有機(jī)溶劑，導(dǎo)致檢測方法的高成本進(jìn)一步降低了其在摻假中的推廣應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附法具有高特異性和高靈敏度，特別適用于乳中低含量蛋白的分析[11]，如利用牛乳β-酪蛋白的特異性抗體進(jìn)行山羊乳及其制品中牛乳摻假的鑒定[12]。該法常受限于摻假蛋白特異性抗體的缺乏，以及加工過程中的熱處理帶來的目標(biāo)蛋白抗原表位的改變。相較于前面3 種方法，毛細(xì)管電泳因沒有固定相，故避免了固定相或有機(jī)改性劑帶來的蛋白構(gòu)象變化[13]；而且毛細(xì)管電泳只需很少量的樣品和緩沖溶液，顯著降低了溶劑的消耗[14]。毛細(xì)管電泳技術(shù)因高分辨率、 高分離度和快速簡便的優(yōu)點(diǎn)，故在乳蛋白研究領(lǐng)域，尤其是牛乳蛋白的摻假鑒定中顯示出極大的應(yīng)用前景。

毛細(xì)管電泳技術(shù)首先解決了乳中低豐度蛋白的分離鑒定的問題。α-乳白蛋白在牛乳中的含量較低（占總蛋白的3.7%～5.0%），加工過程還會導(dǎo)致進(jìn)一步的降解，較難檢測。Gutierrez 等[15]利用毛細(xì)管電泳建立一種分離和鑒定奶粉中α-乳白蛋白的方法，檢測限低至0.01 mg/mL。其次，毛細(xì)管電泳解決了同一種蛋白不同亞型的分離鑒定的難題。β-乳球蛋白存在多達(dá)8 種的基因變異體。Paterson 等[16]基于特定pH 下3 種變體的電荷差異，通過優(yōu)化緩沖溶液的種類、濃度、pH 等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了β-乳球蛋白A、B、C 變體的分離和鑒定。第三，毛細(xì)管電泳可以實(shí)現(xiàn)在貯藏、加工過程中發(fā)生水解等變化后的乳蛋白分離鑒定?？煞治鲈先楹蚒HT 乳在貯藏過程中由蛋白水解作用帶來的乳清蛋白占總蛋白的比例變化[17-19]。Recio 等[20]采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法，分別用血纖維蛋白溶酶和凝乳酶處理牛乳和干酪中的酪蛋白，跟蹤其水解過程，鑒別了主要的酪蛋白水解產(chǎn)物，同時分離出凝乳酶作用于αs1-酪蛋白產(chǎn)生的αs1-Ⅰ-酪蛋白和αs1-酪蛋白 f（1-23）以及凝乳酶作用于κ-酪蛋白產(chǎn)生的para-κ-酪蛋白和酪蛋白巨肽。文獻(xiàn)[21]分析干酪和乳清蛋白產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物。

鑒于以上優(yōu)點(diǎn)，毛細(xì)管電泳在乳制品摻假檢測方面顯示出極大的應(yīng)用前景[8，22-27]。牛乳價格低廉，常被加入山羊乳和綿羊乳中。Recio 等[23]利用毛細(xì)管電泳檢測綿羊乳制成的干酪中摻加的山羊乳或牛乳，山羊乳和牛乳的摻入量檢測限分別為2%和5%。文獻(xiàn)[25]基于αs1-酪蛋白的電泳峰，用毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測山羊乳中添加的牛乳，檢測限低至1%。本文利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法，通過優(yōu)化分離緩沖體系及其pH、進(jìn)樣條件、毛細(xì)管長度、電壓等條件，利用優(yōu)化的方法建立原料牛乳的蛋白電泳圖譜，確定電泳圖譜中出現(xiàn)的牛乳蛋白共有峰，鑒定每個電泳峰代表的乳蛋白種類，并用相似度和含量相似度對獲得的電泳圖譜進(jìn)行評價。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料牛乳及巴氏殺菌牛乳采自北京三元集團(tuán)綠荷渠頭牧場，α-乳白蛋白 （α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、α-酪蛋白 （α-CN）、β-酪蛋白 （β-CN）和κ-酪蛋白（κ-CN）標(biāo)準(zhǔn)品及二硫蘇糖醇購于美國Sigma 公司，電泳用尿素購于美國Amresco 公司，大豆分離蛋白（大于90%）購于河南正興食品添加劑有限公司，水解膠原蛋白（大于95%）購于鄭州藍(lán)天生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀及未涂層毛細(xì)管柱，美國Beckman 公司；低溫離心機(jī)，美國Thermo Scientific 公司；超純水儀，ELGA Lab Water 公司；KH5200DB 型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；精密酸度計，北京哈納科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳樣品的采集及制備 試驗(yàn)所用牛乳樣品為超市購買的巴氏殺菌牛乳和從奶牛場采集的原料牛乳。原料牛乳在同一天采集自同一奶牛場的32 頭荷斯坦乳牛，將采集得到的原料牛乳進(jìn)行體細(xì)胞數(shù)和蛋白含量測定，從中選取16 份原料牛乳作為被測樣品（體細(xì)胞數(shù)<25 萬個/mL，蛋白含量為2.90～3.20 g/100 mL）。將待測牛乳樣品在4℃條件下3 100 g 離心20 min 除去脂肪，取一定體積的下層脫脂乳，與樣品緩沖液按1∶4（體積比）比例混合，室溫放置1 h 后用0.45 μm 的水系濾膜過濾，備用。

1.3.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離條件的優(yōu)化 采用非涂層毛細(xì)管（內(nèi)徑50 μm）進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置柱溫為35 ℃，紫外檢測波長為214 nm，選擇樣品緩沖液pH 為8.0，羥丙基甲基纖維素為添加物[28]。優(yōu)化參數(shù)包括進(jìn)樣壓力和時間（0.5，1.0 psi，5，10s），毛細(xì)管柱長度（50，60 cm），電泳緩沖液體系（檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液）和緩沖液pH（2.5，2.75，3.0），分離電壓（15，20，25 kV）。其中，所用緩沖液的配制方法如下：

1）檸檬酸電泳緩沖溶液 0.05%羥丙基甲基纖維素，6 mol/L 尿素，20 mmol/L 檸檬酸三鈉，用32 mmol/L 檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH 至3.0，2.75 和2.5，定容。用0.45 μm 水系濾膜對配制好的溶液進(jìn)行過濾，超聲，備用。

2）檸檬酸上品緩沖液 40 mmol/L 檸檬酸三鈉，0.1%DTT，6 mol/L 尿素，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，定容。用0.45 μm 水系濾膜對配制好的溶液進(jìn)行過濾，超聲，備用。

3）磷酸鹽電泳緩沖溶液 20 mmol/L 磷酸二氫鈉，0.05%羥丙基甲基纖維素，6 mol/L 尿素，用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH 至3.0，2.75 和2.5，定容。用0.45 μm 水系濾膜對配制好的溶液進(jìn)行過濾，超聲，備用。

4）磷酸鹽上樣緩沖液 40 mmol/L 磷酸二氫鈉，0.1%DTT，6 mol/L 尿素，用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，定容。用0.45 μm 水系濾膜對配制好的溶液進(jìn)行過濾，超聲，備用。

1.3.3 牛乳樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電泳測定 取處理好的牛乳樣品1 mL 于進(jìn)樣瓶中，按照優(yōu)化好的電泳條件進(jìn)行測定，每個樣品重復(fù)測定兩次。毛細(xì)管使用前的活化以及實(shí)驗(yàn)過程中毛細(xì)管的清洗程序如下：

1）毛細(xì)管使用前的活化程序?yàn)椋赫{(diào)節(jié)壓力至20 psi，先 后 用0.1 mol/L NaOH 溶 液、0.1 mol/L HCI 溶液和超純水沖洗10，5 和2 min；

2）樣品測定開始前，毛細(xì)管的沖洗程序?yàn)椋赫{(diào)節(jié)壓力至70 psi，先后用超純水、0.1 mol/L NaOH 溶液、超純水、電泳緩沖液分別沖洗1，2，2和5 min；

3）樣品測定結(jié)束后，毛細(xì)管的沖洗程序?yàn)椋赫{(diào)節(jié)壓力至70 psi，用0.1 mol/L NaOH 溶液沖洗10 min，再調(diào)節(jié)壓力至50 psi，先后用0.1 mol/L HCI 溶液和超純水沖洗10 min 和2 min。

1.3.4 毛細(xì)管區(qū)帶電泳的方法學(xué)評價

1）重復(fù)性試驗(yàn) 將同一牛乳樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，獲得毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜，計算圖譜中各蛋白峰相對遷移時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察方法的精密度。

2）回收率試驗(yàn) 將牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入到牛乳樣品中，獲得毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜，計算加標(biāo)回收率，考察方法的準(zhǔn)確度。

1.3.5 牛乳蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜的建立 將試驗(yàn)樣品按照優(yōu)化好的電泳條件進(jìn)行測定，得到各自的電泳圖譜，并按以下步驟對電泳圖譜進(jìn)行處理。對獲得的一系列電泳圖譜進(jìn)行評價并得到牛乳蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳對照圖譜。選擇各譜圖中峰共有率不低于70%的作為確定指紋峰的依據(jù)。

采用牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對電泳圖譜中的主要乳清蛋白 （α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）和酪蛋白（α-、β-和κ-酪蛋白）進(jìn)行標(biāo)定。并結(jié)合已有的文獻(xiàn)報道，確定出這幾種蛋白峰之外的電泳峰所代表的乳蛋白種類[29]。

1.3.6 摻雜牛乳樣品的制備 外源蛋白溶液的準(zhǔn)備：各自稱取0.03 g 大豆分離蛋白和水解膠原蛋白，分別溶于1 mL 超純水中，充分?jǐn)嚢枋谷芙馄胶猓ㄗⅲ鸿b于蛋白本身的純度，大豆分離蛋白和水解膠原蛋白分別按照蛋白含量為90%，95%和85%進(jìn)行計算）。將所得的外源蛋白溶液與樣品緩沖液按1∶4（V/V）比例混合，室溫下放置1 h，0.45 μm 濾膜過濾，備用。在脫脂牛乳中分別添加50%，40%，30%，20%，10%，5%和2%（體積比）的大豆分離蛋白溶液和水解膠原蛋白溶液，得到摻雜的牛乳樣品，再將摻雜樣品與樣品緩沖液按1∶4（V/V）比例混合，室溫下放置1 h，0.45 μm 濾膜過濾，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離條件的優(yōu)化

2.1.1 進(jìn)樣條件的選擇 在一定時間范圍內(nèi)，進(jìn)樣時間越長，檢測的靈敏度越高；但當(dāng)進(jìn)樣時間超過10 s 時，出現(xiàn)電泳峰展寬，峰拖尾等峰形變差的負(fù)面效應(yīng)，還有部分峰重疊，分離度下降[30]。因此選擇進(jìn)樣條件為壓力：0.5，1.0 psi 和時間：5，10 s，進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，同時增加進(jìn)樣壓力和進(jìn)樣時間，使電泳圖譜中最高峰的縱坐標(biāo)響應(yīng)值從25 mAU 增加到了55 mAU，得到顯著提高。因此選擇進(jìn)樣條件為1.0 psi，10 s。

2.1.2 緩沖體系的選擇 如圖1所示，采用檸檬酸鹽緩沖體系（A）作為緩沖溶液時，得到的樣品電泳圖譜出峰不全，低含量蛋白的電泳峰響應(yīng)值較低，并且有圖譜基線不穩(wěn)的情況出現(xiàn)；而用磷酸鹽緩沖體系（B）作為電泳緩沖液和樣品緩沖液，得到的樣品電泳圖譜分離效果較好。因此本試驗(yàn)選用磷酸鹽緩沖體系。

2.1.3 毛細(xì)管長度的選擇 毛細(xì)管長度的選擇取決于所檢測體系的復(fù)雜程度以及對于分離度的要求。復(fù)雜體系一般選用較長的毛細(xì)管，毛細(xì)管長度越長，分離度越好，但隨著毛細(xì)管長度的增加，樣品的遷移時間也隨之變長，導(dǎo)致檢測所需時間延長。巴氏殺菌牛乳在不同長度的毛細(xì)管下的電泳圖如圖1所示，對于本試驗(yàn)中的牛乳樣品，長度為60 cm（D）的毛細(xì)管相對于50 cm（C）的毛細(xì)管分離效果更好，因此選擇長度為60 cm 的毛細(xì)管進(jìn)行試驗(yàn)。

圖1 不同緩沖體系（a、b）及不同毛細(xì)管長度（c、d）對巴氏殺菌乳分離效果的影響Fig.1 Effects of buffer system （a，b）and capillary length （c，d）on the separation of pasteurized milk

2.1.4 電泳緩沖液pH 的選擇 巴氏殺菌牛乳在不同pH 條件下的毛細(xì)管電泳圖如圖2所示。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著電泳緩沖液pH 的降低，牛乳蛋白的分離度增加，但是pH 的降低會帶來更高的離子強(qiáng)度，從而使電滲流增加，焦耳熱增多，導(dǎo)致靈敏度下降。并且當(dāng)電泳緩沖液的pH 降為2.5 時（圖2c），運(yùn)行電流顯著增大，且電流不穩(wěn)定。因此，選擇電泳緩沖液的最佳pH 為2.75（圖2b）。

2.1.5 分離電壓的選擇 巴氏殺菌牛乳在不同的分離電壓下的毛細(xì)管電泳圖如圖2所示。當(dāng)分離電壓降低時，電流隨之下降，減小了焦耳熱的產(chǎn)生。但是隨著分離電壓的降低，樣品組分的出峰時間明顯延后。當(dāng)分離電壓分別設(shè)置為25 kV （圖2d）、20 kV（圖2e）和15 kV（圖2f）時，被測樣品的電泳圖譜中首個樣品峰的出峰時間分別為12.733，16.204 min 和大于20 min，且當(dāng)分離電壓為15 kV 時，樣品的總分析時間大于30 min。因此選擇最佳分離電壓為25 kV。

綜合以上結(jié)果，本文中最終確定的毛細(xì)管電泳的最佳檢測條件為：未涂層毛細(xì)管柱（60 cm×50 μm I.D.，有效長度：57 cm），磷酸鹽緩沖體系，電泳緩沖液pH 2.75，樣品緩沖液pH 8.0，分離電壓25 kV，壓力進(jìn)樣：1.0 psi，10 s，柱溫35 ℃，紫外檢測波長214 nm。

2.2 牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法評價

將經(jīng)處理的各標(biāo)準(zhǔn)溶液按所選條件測定，并記錄數(shù)據(jù)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以各蛋白的峰面積A 對濃度c 進(jìn)行線性回歸，得到各蛋白的線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)（表1）。5 種主要牛乳蛋白的相對遷移時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，加標(biāo)回收率均在85%～105%之間，表明方法的精密度和準(zhǔn)確度較好。

2.3 牛乳蛋白毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜的建立

2.3.1 電泳圖譜指紋峰的確定 對收集的原料乳樣品進(jìn)行分析，記錄各自的電泳圖。通過計算樣品圖譜中各組分峰的共有率，得到共有峰14 個，各樣品共有峰的遷移時間如表2，各共有峰遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5%以內(nèi)。

圖2 不同pH 條件（a-c）及不同分離電壓（d-f）對巴氏殺菌乳分離的影響Fig.2 Effects of pH （a-c）and separation voltage （d-f）on the separation of pasteurized milk

表1 各蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及對應(yīng)的重復(fù)性和回收率Table 1 The regression equation，correlation coefficient，linear range and the corresponding repeatability and recovery of each protein standards

2.3.2 電泳圖譜指紋峰的標(biāo)定 采用牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品對電泳圖譜中的主要乳清蛋白 （圖3a，α-La和圖3b，β-Lg）和酪蛋白（圖3c-e，分別為α-CN、β-CN 和κ-CN），結(jié)合它們各自的出峰順序，對原料乳電泳圖譜進(jìn)行定性，如圖3所示。部分蛋白（圖3f 中峰10～14）峰因缺乏相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)已有報道，確定電泳圖譜中其余電泳峰所代表的乳蛋白種類（圖3f）。

表2 牛乳蛋白共有峰的遷移時間Table 2 The migration time of the peaks in common

（續(xù)表2）

圖3 牛乳蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和原料乳的電泳圖譜Fig.3 The electrophoresis of the milk protein standards and raw milk

2.3.3 電泳圖譜的評價 色譜指紋圖譜相似度是評價指紋圖譜穩(wěn)定性的有效手段之一，能夠反映樣品中各組分的分布比例，目前最常用的評價指標(biāo)為向量夾角余弦相似度Scosθ。Scosθ的值越接近1，樣品指紋圖譜與參照指紋圖譜在組分分布上的一致性越高。此外，圖譜間含量上的相似性常用含量相似度U 及圖譜總積分峰面積與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中總積分峰面積的百分比I（宏觀含量相似度）兩個指標(biāo)評價，I 和U 越接近100%表明樣品指紋圖譜化學(xué)成分的含量與對照指紋圖譜中化學(xué)成分的含量越相似。

式中，xti——待測圖譜共有峰的峰面積；xsi——參照圖譜共有峰的峰面積；n——共有峰個數(shù)；ri——樣品指紋圖譜中峰面積與對照圖譜中對應(yīng)峰面積的比值；Ai——指紋圖譜中各個峰的面積；Ao——標(biāo)準(zhǔn)對照指紋圖譜的峰面積總和。

被測樣品的Scosθ，U 值，I 值如表3所示。由結(jié)果可知，雖然樣品的個體間存在差異，但被測牛乳樣品的乳蛋白電泳圖譜間的相似度均大于0.900，說明被測牛乳樣品的乳蛋白組成基本相似。

表3 牛乳蛋白相似度評價結(jié)果Table 3 The similarity evaluation results of milk proteins

2.4 原料乳蛋白摻雜檢測

對分別添加不同比例的大豆分離蛋白、 水解膠原蛋白和小麥面筋蛋白的牛乳樣品進(jìn)行測定，將得到的電泳圖與牛乳樣品的電泳圖進(jìn)行比較，從組分的遷移時間和峰面積判斷摻雜乳的情況。

2.4.1 添加大豆分離蛋白摻雜乳的檢測 由圖4a可知，大豆分離蛋白的出峰時間為12.0～17.0 min之間和22.542 min，由前文結(jié)果（圖3f）可知，α-La、β-Lg 及α-CN（αs2-CN、αs1-CN 和αs0-CN）的出峰時間分別為13.056，13.776 min 及15.196，16.212 min 和16.888 min，大豆分離蛋白在12.0～17.0 min 之間的峰與上述3 種乳蛋白峰重合。因此，添加大豆分離蛋白后，原牛乳樣品中的α-La、β-Lg 以及α-CN 溶質(zhì)峰的峰面積均明顯增大，通過比較發(fā)現(xiàn)，峰1 可以作為區(qū)別牛乳和摻入大豆分離蛋白牛乳樣品的特征峰，如圖4b所示。

圖4 摻入30%大豆分離蛋白（a-c）及水解膠原蛋白（d-f）的原料乳毛細(xì)管電泳圖譜Fig.4 The capillary electrophoresis of raw milk contained 30% soy isolate protein （a-c）and hydrolyzed collagen （d-f）

2.4.2 添加水解膠原蛋白摻雜乳的檢測 由圖4d可知，水解膠原蛋白的出峰時間為11.275，15.967，16.817，17.137 min 和17.438 min，由前文結(jié)果（圖3f）可知，牛乳中α-CN（αs2-CN、αs1-CN 和αs0-CN）、κ-CN、β A1-CN 及β A2-CN 的出峰時間分別為15.196，16.212 min 和16.888 min 及17.986，18.588 min 和19.202 min。如圖所示，水解膠原蛋白在15.967～17.438 min 之間的峰與上述乳蛋白中的α-CN 和κ-CN 的峰重合。添加水解膠原蛋白后，通過比較，確定峰2 作為區(qū)別牛乳和添加水解膠原蛋白牛乳的特征峰（圖4e）。

2.4.3 大豆分離蛋白水解膠原蛋白的摻假檢出限將大豆分離蛋白和水解膠原蛋白的特征峰面積與添加比例進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如表4所示。當(dāng)大豆分離蛋白和水解膠原蛋白的添加量較大時，它們的特征峰面積與添加量之間呈正相關(guān)，線性較好。當(dāng)大豆分離蛋白和水解膠原蛋白的添加量分別降至4.5%和4.8%時，其特征峰在電泳圖中的面積已經(jīng)很小，不能測定其峰面積。

表4 大豆分離蛋白添加量與其峰面積的關(guān)系Table 4 The relationship between the area of the peaks and the content of soy isolate protein

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離條件中的緩沖體系及其pH、進(jìn)樣條件、毛細(xì)管長度、分離電壓，最終建立起適用于牛乳蛋白的最佳檢測條件為選用60 cm 的毛細(xì)管柱，以pH 2.75 的磷酸鹽緩沖液作為電泳緩沖液，采用6.895 kPa、10 s 的壓力進(jìn)樣方式，分離電壓設(shè)為25 kV。利用優(yōu)化后的方法，以采集到的原料乳進(jìn)行測定，最終建立起牛乳蛋白中14 種特征組分的毛細(xì)管區(qū)帶電泳圖譜。此外，建立起常見的摻假原料——大豆分離蛋白和水解膠原蛋白在本方法上的特征定性峰、 定量回歸方程（相關(guān)性指數(shù)均大于0.996）以及檢測限（4.5%和4.8%）。本文建立的毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法可以應(yīng)用于原料乳收購環(huán)節(jié)，作為牛乳蛋白摻假的一種快速、可靠的檢測方法。