章喜昌

【摘 要】通過測(cè)定氰戊菊酯在不滅菌土壤和滅菌土壤中碳同位素比值變化明確微生物降解氰戊菊酯過程會(huì)產(chǎn)生顯著的穩(wěn)定碳同位素分餾效應(yīng)，從而說明穩(wěn)定同位素技術(shù)可以應(yīng)用于氰戊菊酯微生物降解的定性評(píng)估。

【關(guān)鍵詞】碳同位素;氰戊菊酯;同位素分餾

中圖分類號(hào)： X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2019）08-0187-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.08.081

【Abstract】By measuring the carbon isotope ratios of fen valerate in sterilized and non-sterilized soils， it is clear that the process of microbial degradation of fen valerate will produce significant stable carbon isotope fractionation effect， which indicates that stable isotope technology can be applied to qualitative assessment of microbial degradation of fen valerate.

【Key words】Carbon isotope; Fen valerate; Isotope fractionation

穩(wěn)定性同位素技術(shù)從20世紀(jì)60年代開始定型并逐步發(fā)展起來的一門分支學(xué)科，在礦床學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物工程、食品 工程等研究領(lǐng)域廣為應(yīng)用，[1-2]由于其分析結(jié)果精確可靠、故已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境污染物的來源分析與示蹤研究。

在研究環(huán)境中有機(jī)污染物降解過程的疑惑之一在于它們可以通過多種過程被降解，比如有氧和厭氧降解，生物和非生物轉(zhuǎn)化等。而通過穩(wěn)定性同位素分析技術(shù)，我們很方便的確認(rèn)污染物降解的主導(dǎo)過程及其同位素富集因子，并識(shí)別其反應(yīng)機(jī)理。有機(jī)污染物的降解途徑受環(huán)境條件（如氧氣含量，酸堿度）的影響，并產(chǎn)生同位素分餾差異。Rosell等）研究了甲基叔丁基醚（MTBE）在有氧降解（C-H鍵氧化）、厭氧降解（SN2反應(yīng)）和酸性水解（SN1反應(yīng)）時(shí)的C和H同位素分餾，Elsner[8]對(duì)這些不同降解途徑的δ13C和δD值分別進(jìn)行了線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)δ13C和δD呈現(xiàn)出較好的線性相關(guān)關(guān)系。因此，我們可以用穩(wěn)定同位素分析技術(shù)研究污染物的降解途徑，從而揭示其降解機(jī)理。

定量評(píng)估農(nóng)藥的微生物降解一直環(huán)境研究熱點(diǎn)之一，傳統(tǒng)方法在評(píng)估環(huán)境中農(nóng)藥的微生物降解時(shí)，是通過測(cè)定一些微生物活性指標(biāo)來定性和定量的，如底物和電子受體濃度的降低，微生物量和降解產(chǎn)物的增長等，但這些基于濃度的指標(biāo)并不能真實(shí)反映農(nóng)藥的微生物降解。一些自然過程，如揮發(fā)、稀釋和吸附等，也會(huì)引起農(nóng)藥濃度的變化，而農(nóng)藥本身并沒有發(fā)生降解。此外，在復(fù)雜的自然環(huán)境體系中很難準(zhǔn)確獲得底物、電子受體和降解物的物料平衡。有研究表明，在微生物降解過程中，包含輕同位素（如12C）的鍵反應(yīng)速率相較于重同位素更快，引起重同位素（如13C）在殘留的農(nóng)藥中富集。因此，我們可以利用穩(wěn)定同位素分析技術(shù)研究同位素組成與生物降解率的關(guān)系，從而對(duì)農(nóng)藥的微生物降解進(jìn)行定性分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與耗材

IsoPrime 100 同位素比質(zhì)譜儀，配備Agilent 7890A 氣相色譜儀和GC-V燃燒轉(zhuǎn)化爐，購自英國GV公司;XPE26C 微量分析天平，購自瑞士MettlerToledo 公司;氦氣（純度>99.999%）、氧氣（純度≥99.9992%）、二氧化碳（參考?xì)?，純度?9.9995%），均購自上海比歐西氣體工業(yè)有限公司;

IAEA600 咖啡因（δ13C=-27.771‰），購自國際原子能機(jī)構(gòu)，作為參考?xì)庑?zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)物;氰戊菊酯（fen valerate）固體標(biāo)樣，純度為99.7%

1.2 樣品處理

土壤樣品采自農(nóng)田表層土（0～10cm深），在陰暗干燥，壓碎土塊，剔除石塊、動(dòng)植物殘?bào)w等雜物后，再鋪成薄層，使其自然風(fēng)干，過2mm的篩用于實(shí)驗(yàn)。

取20個(gè)50mL錐形瓶（帶橡膠塞），用分析電子天平稱取5.0000±0.0250g土壤樣品分別加入錐形瓶中并使其在瓶底攤平，用1mL移液槍在每個(gè)錐形瓶中均勻噴灑3mL的自來水，塞上橡膠塞后稱量記錄下每個(gè)錐形瓶的總質(zhì)量。將錐形瓶放入恒溫?fù)u床，以30℃，120r/min振蕩30min，然后放入恒溫培養(yǎng)箱，在30℃下避光培養(yǎng)2周。

從恒溫培養(yǎng)箱取出錐形瓶，均分為A、B兩組，將A組置于高壓滅菌鍋，在121℃下滅菌3次，每次20 min。然后再將A、B兩組分別均分為A1、A2組和B1、B2組，用1mL移液槍在A1和B1每個(gè)瓶中均勻噴灑1mL濃度為10mg/L的氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，在A2和B2中均勻噴灑1.5mL濃度為50mg/L的氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將錐形瓶置于恒溫?fù)u床以30℃，120r/min振蕩10min，使氰戊菊酯均勻分布于土壤樣品中，待正己烷揮發(fā)殆盡后塞緊瓶塞，通過稱重在A、B組中分別補(bǔ)加滅菌的和不滅菌的自來水后再塞緊瓶塞。再放入恒溫培養(yǎng)箱，在30℃下避光培養(yǎng)。

每隔15天從培養(yǎng)箱中取出A1、A2、B1和B2各三個(gè)樣品用于分析其中氰戊菊酯的碳同位素組成（δt13C）：選用索氏提取法提取土壤中的氰戊菊酯：連接好索氏提取裝置，用正己烷索提洗滌玻璃纖維濾筒和棉花8小時(shí)后，將正己烷換成160 mL的索氏提取液（正己烷：丙酮/v：v=7：1），在錐形瓶中加入適量無水硫酸鈉，與土壤樣品攪拌均勻后全部轉(zhuǎn)移至玻璃纖維濾筒中，連接好索氏提取裝置，索氏提取24小時(shí)后將索提管及濾筒中的提取液一并轉(zhuǎn)入平底燒瓶中。在45℃水浴溫度，75r/min轉(zhuǎn)速和450hPa初始?jí)毫ο掠眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)提取液進(jìn)行濃縮，隨著提取液的不斷減少，逐步降低壓力，最后在360hPa壓力下濃縮至1～2mL。

用正己烷濕法裝柱，在玻璃層析柱中裝好填料，從下到上依次為5g無水硫酸鈉、5g弗羅里硅土、3.5g硅膠和5g無水硫酸鈉。然后將濃縮后的提取液轉(zhuǎn)移到層析柱，用100 mL的洗脫液（正己烷：丙酮/ v：v=9：1）進(jìn)行洗脫，并收集于平底燒瓶。在45℃水浴溫度，75r/min轉(zhuǎn)速和400hPa初始?jí)毫ο掠眯D(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)柱后洗脫液進(jìn)行濃縮，隨著洗脫液的不斷減少，逐步降低壓力，最后在360hPa壓力下濃縮至1～2mL。

將濃縮后的柱后洗脫液氮吹至近干，用100μL正壬烷溶解轉(zhuǎn)移至150μL玻璃內(nèi)襯管進(jìn)GC-C-IRMS分析氰戊菊酯的同位素組成（δt13C）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

其中，R（13C/12C）sample是有機(jī)化合物樣品中的碳同位素比值，R（13C/12C）standard是國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的碳同位素比值，碳同位素的國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是美國南卡羅來納州白堊系皮狄組的美洲擬箭石（PDB），相對(duì)差值δ一律用千分?jǐn)?shù)表示，樣品結(jié)果允許標(biāo)準(zhǔn)偏差為<0.3‰。如果測(cè)得的δ值是正的，表示樣品相比于標(biāo)準(zhǔn)13C富集，反之，則表示樣品相比于標(biāo)準(zhǔn)13C貧化。

2 結(jié)果與討論

隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，氰戊菊酯的δ13C值的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。經(jīng)過60天的培養(yǎng)，在非滅菌組中觀測(cè)到了顯著的穩(wěn)定碳同位素分餾，加標(biāo)濃度為2mg/kg的土壤中氰戊菊酯的δ13C值從-28.62±0.31‰上升到-25.54±0.19‰，而加標(biāo)濃度為15mg/kg的土壤中氰戊菊酯的δ13C值從-28.62±0.31‰上升到-26.78±0.28‰。以此同時(shí)，滅菌土壤中氰戊菊酯的δ13C值只發(fā)生了非常不顯著的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，主要引起氰戊菊酯降解過程中碳穩(wěn)定同位素分餾的是微生物降解，而不是非生物降解。

眾所周知，在代謝特定某些有機(jī)質(zhì)過程中，微生物傾向于利用分子中的較輕同位素（例如12C），從而導(dǎo)致剩余有機(jī)質(zhì)中含重同位素（例如13C）的增加，從而導(dǎo)致同位素分餾現(xiàn)象的發(fā)生。盡管如此，在某些特定的環(huán)境中，微生物降解與穩(wěn)定同位素分餾并不完全存在著因果關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)殘留氰戊菊酯的δ13C值的明顯增加說明了氰戊菊酯的微生物降解能引起穩(wěn)定碳同位素分餾現(xiàn)象，這表明應(yīng)用穩(wěn)定碳同位素分析技術(shù)來指示氰戊菊酯的衰減過程中存在微生物降解并進(jìn)一步評(píng)估其生物降解率成為了可能。

3 結(jié)論

通過碳穩(wěn)定同位素質(zhì)譜技術(shù)，我們比較了氰戊菊酯在不滅菌土壤和滅菌土壤中碳同位素比值隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：氰戊菊酯在土壤中的非生物降解過程對(duì)穩(wěn)定碳同位素比值δ13C的變化沒有產(chǎn)生明顯作用，而微生物降解過程引起了顯著的穩(wěn)定碳同位素分餾，因此，穩(wěn)定同位素分析技術(shù)可以應(yīng)用于氰戊菊酯衰減過程中微生物降解的定性評(píng)估。

【參考文獻(xiàn)】

[1]林光輝.穩(wěn)定同位素生態(tài)學(xué).北京：高等教育出版社，2013：5.

[2]白志鵬，張利文，彭林，等.穩(wěn)定性同位素在污染物溯源與 示蹤中的應(yīng)用[J].城市環(huán)境與城市生態(tài)，2006，19（4）：29-32.