程 楊， 聶繼云*， 劉紅弟， 閆 震， 匡立學(xué)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(興城)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品及苗木質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(興城)，遼寧興城 125100)

β-環(huán)糊精(β-Cyclodextrin，β-CD)，它是直鏈淀粉在葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的作用下生成的環(huán)狀低聚糖，具有外親水內(nèi)疏水的圓筒形中空結(jié)構(gòu)，客體分子的疏水基團(tuán)能夠進(jìn)入到β-CD的疏水空腔之中，可形成主-客體超分子包合物[1 - 4]，避免去活碰撞，減少分子移動(dòng)自由度，增加發(fā)射速度常數(shù)，保持適宜的微環(huán)境以及保護(hù)激發(fā)態(tài)不與大體積水分子和猝滅劑接觸，從而引起體系熒光顯著增強(qiáng)[5 - 7]。近年來(lái)，科研工作者已利用β-CD 增敏熒光法來(lái)測(cè)定蔬菜和水果中農(nóng)藥殘留[8 - 9]。氟氰戊菊酯(Flucythrinate)是一種非三元環(huán)結(jié)構(gòu)含氟的合成擬除蟲菊酯殺蟲劑，主要應(yīng)用于棉花、蔬菜、果樹等作物上多種害蟲的防治，對(duì)葉螨有一定抑制作用。氟氰戊菊酯具有潛在的神經(jīng)毒性[10]，并且長(zhǎng)期接觸可能會(huì)引起內(nèi)分泌紊亂等問題[11]。因此，其殘留問題必然會(huì)給消費(fèi)者帶來(lái)潛在的危險(xiǎn)并引起人們的高度重視。氟氰戊菊酯的測(cè)定方法多為氣相色譜法[12 - 13]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14 - 15]。但這些方法操作繁瑣耗時(shí)，需要大型儀器和專業(yè)操作人員等缺點(diǎn)限制其應(yīng)用，因此，建立一種氟氰戊菊酯殘留快速準(zhǔn)確的分析方法顯得尤為迫切。

熒光分析法具有實(shí)時(shí)檢測(cè)、靈敏度高、分析快速、操作簡(jiǎn)單、試樣用量少等優(yōu)點(diǎn)，使其在農(nóng)藥殘留分析中受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并且在痕量物質(zhì)的檢測(cè)方面也具有很好的應(yīng)用前景[16 - 17]。本文利用熒光光譜法研究了β-CD與氟氰戊菊酯的超分子相互作用，確定了包合比、包合常數(shù)，利用其自身產(chǎn)生的熒光信號(hào)，通過β-CD對(duì)其的增敏作用，可有效降低氟氰戊菊酯的檢出限，據(jù)此建立一種直接、快速、高靈敏度測(cè)定氟氰戊菊酯含量的新方法，為β-CD作為超分子主體化合物對(duì)客體分子的熒光增敏效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型熒光光譜儀(日本，日立公司)；雷磁pHS-3E型數(shù)顯式pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器有限公司)；VT6060M真空干燥箱(美國(guó)，賽默飛世爾科技公司)。

β-環(huán)糊精(β-CD)(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)，二次重結(jié)晶，真空干燥后備用；其它試劑均為分析純。所有實(shí)驗(yàn)用水均為高純水。

1.2 溶液的配制

氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用95%乙醇稀釋100 mL，然后再稀釋成0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。β-CD溶液:準(zhǔn)確稱取2.8375 gβ-CD，用高純水配制成濃度為1.0×10-2mol/L貯備溶液。B-R緩沖溶液:取0.272 mL 85%H3PO4，0.464 mL 36%冰HAc和0.2473 g H3BO3，用高純水配成100 mL的三酸混合液(0.04 mol/L)；將配制好的三酸混合溶液與不同體積NaOH溶液(0.2 mol/L)混合，可得到不同pH的B-R緩沖溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

移取1 mL 0.1 μg/mL的氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于10 mL比色管中，依次加入不同體積的β-CD(1.0×10-2mol/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，1 mL的B-R緩沖溶液(pH=5.02)，加高純水稀釋至刻度，充分搖勻，室溫下放置5 min后，在λex=251 nm，λem= 306 nm的條件下測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 氟氰戊菊酯的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜

按照實(shí)驗(yàn)方法，在室溫下進(jìn)行熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的掃描，掃描波長(zhǎng)200～700 nm，掃描速度為2 400 nm/min。最后確定氟氰戊菊酯的λex=251 nm，λem=306 nm，儀器狹縫寬度均為2.5 nm。

2.2 pH值對(duì)氟氰戊菊酯熒光強(qiáng)度的影響

采用B -R緩沖溶液考察了pH=1.98～11.20范圍內(nèi)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的變化。由圖1可以看出，β-CD包合氟氰戊菊酯的熒光強(qiáng)度在pH為1.98～6.09范圍內(nèi)較為穩(wěn)定，當(dāng)體系pH=5.02時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。本實(shí)驗(yàn)選擇pH=5.02作為體系熒光測(cè)定的最佳pH值，B-R緩沖溶液用量為1 mL。

2.3 氟氰戊菊酯與β -CD反應(yīng)時(shí)間對(duì)其熒光強(qiáng)度的影響

取按實(shí)驗(yàn)方法配制溶液8份，測(cè)定反應(yīng)不同時(shí)間的后熒光強(qiáng)度。氟氰戊菊酯與β-CD的反應(yīng)在5～40 min內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度變化不大。實(shí)驗(yàn)選擇反應(yīng)時(shí)間5 min為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件。

2.4 β -CD濃度對(duì)氟氰戊菊酯熒光強(qiáng)度的影響

在pH=5.02條件下，固定氟氰戊菊酯的濃度，分別加入不同體積的β-CD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟氰戊菊酯的熒光強(qiáng)度隨著β-CD濃度的增加而增強(qiáng)(圖2)，當(dāng)加入1.0×10-2mol/Lβ-CD溶液體積達(dá)到4 mL時(shí)，氟氰戊菊酯熒光強(qiáng)度的增加趨于平緩并達(dá)到最大值，這是由于β-CD對(duì)氟氰戊菊酯的包合作用所致。本文選擇1.0×10-2mol/Lβ-CD的加入量為4 mL。

圖1 溶液pH對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 The effect of pH on the fluorescence intensity

圖2 β -CD的加入量對(duì)于熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 The effect of the amount of β -CD on the fluorescence intensity[β -CD]:1.0×10-2 mol/L.1-7:1 mL，1.5 mL，2 mL，2.5 mL，3 mL，3.5 mL，4 mL.inset:Relationship equation curve of β -CD-flucythrinate inclusion complex.

在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用Benesi-Hildebrand的雙倒數(shù)法測(cè)定β-CD包合常數(shù)，根據(jù)公式[8]，將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按1/(F-F0)對(duì)1/[CD]作圖，可得線性關(guān)系較好的直線:y=2.36923×10-4x+0.0351(R2=0.9985)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明β-CD與氟氰戊菊酯之間形成了1∶1的超分子包合物。由直線的截距與斜率之比可求得(圖2內(nèi)插圖):β-CD與氟氰戊菊酯的結(jié)合常數(shù)K=148 L/mol。

圖3 β -CD與氟氰戊菊酯形成包合物的模型Fig.3 A model for the formation of inclusion complexes of β -CD and flucythrinate

由于氟氰戊菊酯的疏水基團(tuán)在疏水作用、氫鍵力及范德華力等非共價(jià)鍵作用的驅(qū)動(dòng)下，進(jìn)入β-CD疏水空腔形成主-客體包合物，從而導(dǎo)致β-CD對(duì)氟氰戊菊酯具有熒光增敏作用，β-CD的空腔尺寸大小與極性對(duì)客體分子氟氰戊菊酯進(jìn)行選擇性識(shí)別包合。這種結(jié)構(gòu)模型(圖3)導(dǎo)致氟氰戊菊酯分子的熒光在β-CD疏水空腔中受到屏蔽和保護(hù)，減少分子的移動(dòng)自由度，避免分子間的去活碰撞，體系的熒光強(qiáng)度增加。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

2.6 工作曲線、檢出限及精密度

在實(shí)驗(yàn)選定的最優(yōu)化條件下，改變氟氰戊菊酯的加入濃度，按照實(shí)驗(yàn)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氟氰戊菊酯的濃度在1～30 ng/mL之間與其熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.9975)，線性回歸方程為:y=4.65x+36.99，計(jì)算方法檢出限(3σ/k)為0.25 ng/mL。對(duì)20份濃度為0.01 μg/mL的氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%。

2.7 實(shí)際樣品分析

分別稱取市售蘋果18.95 g，梨13.28 g，分別切成小塊研磨后，用50 mL 95%乙醇浸泡，過濾后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容后作為樣品溶液。按照實(shí)驗(yàn)方法，在2支10 mL比色管中分別加入1 mL蘋果和梨樣品溶液，再取另外兩支10 mL比色管，分別加入1 mL蘋果和梨樣品溶液和1 mL濃度為0.1 μg/mL的氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定5次(表1)。從表1結(jié)果可以看出，我們建立的基于β-CD熒光光譜法具有很好的測(cè)定值和回收率，說(shuō)明此方法可以應(yīng)用于水果中氟氰戊菊酯的快速檢測(cè)。

表1 水果樣品分析結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本文通過β-CD增敏熒光光譜法測(cè)定水果中氟氰戊菊酯的含量，該方法的線性范圍為1～30 ng/mL，檢出限為0.25 ng/mL，RSD為1.3%。建立的熒光檢測(cè)方法，具有靈敏度高，選擇性好，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足水果中氟氰戊菊酯的檢測(cè)要求，尤其適用于小型實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用研究，對(duì)水果中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)有一定的參考價(jià)值。