李碧芳， 王韋達(dá)， 劉奕雄， 李 意，程 誠(chéng)， 陳 序， 杜業(yè)剛*

(1.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，國(guó)家營(yíng)養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣東)，廣東深圳 518109；2.鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南鄭州 450001)

肉類(lèi)含人體所需的蛋白質(zhì)、脂肪和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，是人們必需的主要副食品之一。從波及歐盟多國(guó)的“馬肉風(fēng)波”到國(guó)內(nèi)的“老鼠肉、狐貍?cè)夂退跞饷俺溲蛉狻钡仁录1]，不僅嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的權(quán)益，同時(shí)也帶來(lái)了諸多食品安全隱患，還可能涉及宗教信仰問(wèn)題，引發(fā)社會(huì)的不安定因素。近年來(lái)，用于物種鑒別和食品鑒定的方法在食品工業(yè)領(lǐng)域和監(jiān)管機(jī)構(gòu)中得到越來(lái)越多的關(guān)注[2]。肉類(lèi)真實(shí)性鑒別最常用的檢測(cè)方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[3 - 6]和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)[7 - 8]技術(shù)。但這兩種方法都存在一定的弊端，核酸的降解和肉品的復(fù)雜基質(zhì)會(huì)影響PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而ELISA易發(fā)生物種間的交叉反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[9]，而且無(wú)法實(shí)現(xiàn)多個(gè)物種的同時(shí)檢測(cè)。

伴隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究日漸成熟，以肽生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為肉類(lèi)物種鑒定提供了一種新思路。通過(guò)高分辨質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)的酶解肽段進(jìn)行分離鑒定，尋找不同物種的專(zhuān)屬特征肽，再利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜提取特征肽的離子對(duì)信息進(jìn)行定性和定量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)肉類(lèi)物種的真實(shí)性鑒定。這種方法具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、高準(zhǔn)確性和高通量等其它方法無(wú)可比擬的優(yōu)越性[10]，已成功應(yīng)用于雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、羊肉和馬肉等成分的鑒別[11 - 16]。相比之下，有關(guān)鵝肉成分鑒定的研究卻極少[17]。本研究基于蛋白質(zhì)組學(xué)，建立了鵝源性成分鑒別的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

EkspertTM nanoLC 400納升液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(TripleTOF?6600，美國(guó)AB SCIEX公司)；Acquity UPLC?超高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters公司)；QTRAP?6500+三重四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜儀(美國(guó)，AB SCIEX公司)；Heraeus Fresco 21型冷凍離心機(jī)(美國(guó)，Thermo Scientific公司)；3-30 K型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)，Sigma公司)；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BC-1000渦旋振蕩器(深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司)；CPA224S型分析天平(德國(guó)，Sartorius公司)；低蛋白吸附離心管(1.5 mL，德國(guó)Eppendorf公司)；刻度離心管(10 mL，美國(guó)Axygen Scientific公司)；超濾離心管(Membrane:10,000 MWCO HY，德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 材料與試劑

碳酸氫銨(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；硫脲(Reagent Plus?≥99.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)(Ultra Pure，VWR Life Science)、尿素(VWR Life Science)、二硫蘇糖醇(DTT，Biotechnology)、碘乙酰胺(IAA，Proteomics)(美國(guó)Amresco公司)；測(cè)序級(jí)修飾胰蛋白酶(Porcine，美國(guó)Promega公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)；乙腈、水(質(zhì)譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸(質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)。實(shí)驗(yàn)前處理用水均為超純水。

雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品均為市售。

1.3 樣品處理

1.3.1 蛋白質(zhì)提取稱(chēng)取1 g切碎后的肉類(lèi)樣品于10 mL離心管中，加入5 mL蛋白裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS)，渦旋振蕩過(guò)夜，以14 000 r/min離心20 min，取上清液至低蛋白吸附離心管中備用。采用Bradford法測(cè)定上清液蛋白濃度。

1.3.2 蛋白質(zhì)酶解根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，移取適量上清液到低吸附離心管中，加入尿素水溶液(8 mol/L)至200 μL，加入4 μL DTT水溶液(1 mol/L)，置于37 ℃恒溫反應(yīng)1 h。冷卻至室溫后加入20 μL IAA水溶液(1 mol/L)，避光反應(yīng)1 h。將上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，于8 ℃、14 000 r/min離心40 min，除去多余的IAA和鹽類(lèi)等小分子成分，并用碳酸氫銨溶液(100 mmol/L)洗滌超濾膜上的蛋白3次(100 μL×3)。向超濾管中加入100 μL碳酸氫銨溶液(100 mmol/L)和10 μL胰蛋白酶溶液(1∶40)，輕輕搖勻，置于37 ℃恒溫酶解5 h，8 ℃、14 000 r/min離心40 min，加入90 μL碳酸氫銨溶液(100 mmol/L)洗滌一次，收集濾液，待質(zhì)譜分析。

1.4 NanoLC-TOF MS條件

色譜條件:Eksigent NanoLC trap C18色譜柱(0.5 mm×350 μm，3 μm)，Eksigent C18色譜柱(150 mm×75 μm，3 μm)。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸水溶液-乙腈(98∶2，V/V)，B為乙腈-含0.1%甲酸水溶液(98∶2，V/V)。梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%～92%A；0.5～50 min，92%～76%A；50～65 min，76%～68%A；65～74 min，68%～50% A；74～75 min，50%～20% A；75～80 min，20% A；80～81 min，20%～95% A；81～90 min，95% A。流速：300 nL/min；進(jìn)樣體積：2 μL。

質(zhì)譜條件：采用納升電噴霧離子源(NanoESI)，正離子掃描模式，噴霧電壓2.3 kV；加熱溫度150 ℃；氣簾氣壓力206.84 kPa，霧化氣壓力41.37 kPa；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用信息依賴(lài)的工作模式(Information Dependent Analysis，IDA)同時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)背景扣除。一級(jí)TOF-MS單張圖譜掃描時(shí)間為250 ms，掃描范圍：m/z350～1 500；每次IDA循環(huán)最多采集30張電荷為2+～5+且單秒計(jì)數(shù)大于150的二級(jí)質(zhì)譜，每張二級(jí)質(zhì)譜的累積時(shí)間為50 ms，每次循環(huán)時(shí)間為1.8 s。

1.5 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(100×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫：35 ℃。流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%A；0.5～4 min，95%～65% A；4～7 min，65%～50%A；7～8 min，50%～10%A；8～10 min，10%A；10～10.5 min，10%～95%A；10.5～12 min，95%A。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：4 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)源，正離子掃描以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)；噴霧電壓：5.5 kV；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：276 kPa；霧化氣壓力：379 kPa；輔助氣壓力：379 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解時(shí)間優(yōu)化

胰蛋白酶在pH為8.0、溫度為37 ℃時(shí)的作用能力最強(qiáng)，因此酶解反應(yīng)在pH相近的碳酸氫銨溶液中進(jìn)行，溫度控制在37±0.5 ℃左右。在上述實(shí)驗(yàn)條件下，酶解的時(shí)間是影響蛋白質(zhì)水解程度的重要因素，實(shí)驗(yàn)考察了酶解2、4、6、8、15 h(過(guò)夜)后質(zhì)譜記錄的各特征肽段的檢測(cè)濃度。結(jié)果表明，鵝肉樣品的酶解時(shí)間為4 h時(shí)，各肽段的檢測(cè)濃度達(dá)最高值且隨后趨于平衡。為了充分水解蛋白質(zhì)并縮短實(shí)驗(yàn)前處理時(shí)間，酶解的反應(yīng)時(shí)間選為5 h。

2.2 數(shù)據(jù)分析

2.2.1 特征肽段的篩選特征肽段是指某一個(gè)蛋白質(zhì)所特有的肽段序列[18]，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可作為區(qū)分物種屬性的生物標(biāo)志物。特征肽段的選擇一般遵循以下原則[19 - 20]：以含7～25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽為宜；不含錯(cuò)切或漏切的酶切位點(diǎn)，對(duì)于豐度較高的肽段可接受一個(gè)漏切位點(diǎn)；要具有穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)；質(zhì)譜檢測(cè)分析時(shí)具有較好的靈敏度和峰形。借助于納升液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)酶解后的多肽溶液進(jìn)行Full MS-IDA掃描，得到高準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入蛋白質(zhì)搜索軟件ProteinPilotTM，參數(shù)設(shè)置為：Sample Type:Identification；Cys Alkylation:Iodoacetamide；Digestion:Trypsin；Instrument:TripleTOF 6600；ID Focus:Biological modifications；Unused ProtScore(Conf)>0.05(10.0%)；Run False Discovery Rate Analysis，并在Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)檢索。本文詳細(xì)比較了雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉這些常見(jiàn)物種的多肽序列，找到60條只存在于鵝肉樣品中的備選特征肽段，然后在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行blast分析，去掉非特異性的肽段，最后留下7條特異性肽段。利用Skyline軟件導(dǎo)出上述7條異性肽段的MRM離子對(duì)信息，并對(duì)離子對(duì)的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，建立UPLC-MS/MS方法。肽段序列和MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 鵝肉的特征肽段及MRM離子對(duì)信息

*Quantitative ion.DP:declustering potential.CE:collision energy.

多肽碎片離子的二級(jí)質(zhì)譜是鑒定特征肽段序列的重要指標(biāo)，其實(shí)際檢測(cè)結(jié)果和理論預(yù)測(cè)的斷裂方式越吻合，此肽段的可信度越高。以鵝肉的特征肽段FFEAVYPIEAR(peptide4)為例，如圖1所示，實(shí)驗(yàn)獲得了7個(gè)與理論斷裂方式相符且信號(hào)響應(yīng)極強(qiáng)(>103)的y碎片離子和2個(gè)高信號(hào)響應(yīng)(>103)的b碎片離子，證明該肽段具有很高的置信度，可用于MRM的驗(yàn)證分析。

圖1 Peptide 4的二級(jí)質(zhì)譜圖(括號(hào)內(nèi)m/z是理論值，括號(hào)外m/z是實(shí)測(cè)值)Fig.1 Diagram of MS2 fragmentation of peptide 4(theoretical ion m/z values were shown in parentheses and observed m/z values were shown outside parentheses)

2.2.2 特征肽段的特異性驗(yàn)證通過(guò)高分辨質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選到的特征肽段，需經(jīng)過(guò)質(zhì)譜的MRM檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證其特異性。選取雞肉、鴨肉、鵝肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品酶解后進(jìn)行測(cè)定，考察各樣品中特征肽段離子對(duì)的保留時(shí)間、子離子匹配度及響應(yīng)強(qiáng)度，選擇僅在鵝肉樣品中存在的離子對(duì)信息，以準(zhǔn)確說(shuō)明該物種的存在性。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，前述7條特征肽段在雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉和羊肉樣品均未檢出，而在鵝肉樣品中全都有質(zhì)譜信號(hào)檢出，如圖2所示。結(jié)果說(shuō)明所篩選的7條鵝肉特征肽段具有特異性，據(jù)此所建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法具有準(zhǔn)確性和可靠性。

圖2 鵝肉特征肽段的提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of marker peptides in goose

2.3 定量研究

本實(shí)驗(yàn)將鵝肉和鴨肉分別提取的多肽溶液，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%、20%、40%、60%和90%的比例依次進(jìn)行混合，通過(guò)UPLC-MS/MS的MRM模式掃描，選擇無(wú)背景干擾峰且信號(hào)響應(yīng)較強(qiáng)的離子對(duì)(表1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察特征肽段的信號(hào)響應(yīng)與鵝肉含量的相關(guān)性。結(jié)果如表2所示，肽段peptide 6的離子對(duì)信號(hào)響應(yīng)較低且線性相關(guān)性較差，不適用于定量分析，其余各特征肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性系數(shù)均大于0.99，可用于鵝肉成分的定量分析。以10倍儀器檢測(cè)信噪比確定方法的定量限，鵝肉的定量限為5%。另外，我們以合成的特征肽段配制成不同濃度的溶液，以10倍儀器檢測(cè)信噪比測(cè)得各肽段定量限的絕對(duì)值在3.5～6.0 fmol之間。

將鵝肉和鴨肉按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、50%和70%的比例進(jìn)行混合制備肉樣，按照1.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理，以?xún)?yōu)化色譜-質(zhì)譜條件分析，將測(cè)得的數(shù)據(jù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算，得出鵝肉的含量比例，以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。結(jié)果如表3所示，回收率在71%～121%之間，測(cè)定值與實(shí)際比例相符，精密度(RSD)小于10%，重復(fù)性較好，說(shuō)明使用該方法能夠可靠地測(cè)定鵝肉成分的含量。

表2 鴨肉中鵝肉含量的線性關(guān)系、定量限及特征肽段定量限的絕對(duì)值

y:peak area.x:mass percentage,%.

表3 鴨肉中鵝肉含量的測(cè)定值、回收率和精密度

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的方法對(duì)購(gòu)自不同酒店的12份鵝肉、5份鴨肉和3份雞肉樣品進(jìn)行了檢測(cè)，以驗(yàn)證方法的適用性。結(jié)果顯示，7條特征肽段在本次鵝肉樣品中都有檢出，而在鴨肉和雞肉樣品中并未檢出，進(jìn)一步證明該方法具有特異性，適用于鵝源性成分的鑒定。

3 結(jié)論

本研究利用納升高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)，結(jié)合蛋白質(zhì)檢索軟件篩選出鵝的備選特征肽段，利用skyline軟件導(dǎo)出的質(zhì)譜參數(shù)，建立了MRM檢測(cè)方法，并對(duì)備選特征肽段進(jìn)行驗(yàn)證，最終確證了7條鵝源性特征肽段。另外，所篩選的特征肽段中有6條肽的質(zhì)譜信號(hào)與鵝肉含量呈線性相關(guān)，能夠準(zhǔn)確地定量鵝肉成分。