龔小波 楊大剛△ 孫誠(chéng)誼 王惠群 劉影

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550004 ；2.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004)

肝癌是當(dāng)前嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康與生命的惡性腫瘤，占全球新發(fā)現(xiàn)癌癥的5.4%，其死亡率高，我國(guó)肝癌死亡率僅次于肺癌居第二位[1]。目前，肝癌以手術(shù)切除結(jié)合放療及化療的綜合治療為主。雖然綜合治療將肝癌的5年生存率提高了近15%，但總體仍未超過(guò)30%[2]。隨著腫瘤免疫學(xué)的不斷進(jìn)展，腫瘤免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)和放、化療之后第四種腫瘤治療的手段，并且有望成為最終攻克腫瘤的方向[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究CIK細(xì)胞在體外對(duì)肝癌細(xì)胞株HEP-G2的殺傷作用及殺傷機(jī)制，為肝癌的細(xì)胞免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、PRMI-1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液(美國(guó)Hyclone公司)；GT-T551無(wú)血清培養(yǎng)基(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；淋巴細(xì)胞分離液(挪威Axis-shield公司)；IFN-γ、IL-1α、CD3McAb、IL-2(美國(guó)Peprotech公司)；臺(tái)盼藍(lán)染液、二甲基亞砜(DMSO)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)偶聯(lián)羊抗兔(二抗)(貴州鼎國(guó)生物技術(shù)公司)；CD3-ECD、CD8-PE、CD56-FITC、CD69-PE、HLA-DR-FITC(美國(guó)Beckman CoμLter 公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(貴州賽蘭博科技公司)；JC-1試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、兔β-actin(上海碧云天生物技術(shù)公司)；PVDF膜、ECL反應(yīng)試劑盒(美國(guó)Amersham公司)；兔抗人Caspase-3(一抗)(北京博奧森生物技術(shù)公司)。CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、低溫離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-tek公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman CoμLter 公司)；Western blot電泳及轉(zhuǎn)印設(shè)備(美國(guó)Bio-rad公司)；熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2細(xì)胞獲取及培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株HEP-G2來(lái)自于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科液氮長(zhǎng)期保存。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CIK細(xì)胞制備：CIK細(xì)胞由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤生物治療中心制備。健康志愿者外周血經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離，分離后的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)用含0.6%自體血清的GT-T551培養(yǎng)基調(diào)至起始密度為2.0×106/L。于第0天加入IFN-γ 1 000 U/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后加入IL-1α 100 U/mL，CD3McAb 50 ng/mL，IL-2 1 000 U/mL繼續(xù)培養(yǎng)。以后根據(jù)培養(yǎng)情況添加含IL-2 1 000 U/mL的GT-T551培養(yǎng)基，并調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×106/mL。CIK細(xì)胞培養(yǎng)至14 d，取少許培養(yǎng)細(xì)胞做流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3CIK細(xì)胞增殖及免疫表型檢測(cè) 培養(yǎng)第1、4、7、10、14 d時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)染液計(jì)數(shù)CIK細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算增殖倍數(shù)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3、CD56、CD8、CD69及HLA-DR的表達(dá)情況以表征CIK細(xì)胞的免疫表型及活化程度。

1.4CIK細(xì)胞殺瘤活性測(cè)定

1.4.1MTT法檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)HEP-G2細(xì)胞殺傷活性 將HEP-G2細(xì)胞作為靶細(xì)胞按20×104/mL加入96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液。12 h后按照效靶比1∶1、2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1加入CIK細(xì)胞，另設(shè)單獨(dú)HEP-G2細(xì)胞組和單獨(dú)CIK細(xì)胞組。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中各培養(yǎng)24、48、72 h。取出孔板振蕩，棄上清，PBS 100 μL洗板2次，1640培養(yǎng)基100 μL/孔，MTT(5 mg/mL)20 μL/孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出孔板1 000 rpm離心5 min，棄上清，DMSO 200 μL/孔，振蕩溶解10 min，用酶標(biāo)儀490 nm，測(cè)OD值，計(jì)算CIK殺瘤活性。殺傷率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-單獨(dú)CIK細(xì)胞組OD值)/單獨(dú)HEP-G2細(xì)胞組OD值]×100%。

1.4.2JC-1熒光染色檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)HEP-G2細(xì)胞殺傷活性 將HEP-G2細(xì)胞作為靶細(xì)胞按130×104/mL加入6孔板，每孔1.5 mL細(xì)胞懸液。12 h后按照效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1加入CIK細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后取出6孔板振蕩，棄上清，PBS 2 mL/孔洗板2次，1640培養(yǎng)液1 mL/孔、JC-1工作液1 mL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。取出孔板棄上清，JC-1緩沖液1 mL/孔洗板2次，1640培養(yǎng)基2 mL/孔，熒光顯微鏡下觀察。

1.5HEP-G2細(xì)胞中Caspase-3蛋白的表達(dá)情況 將HEP-G2細(xì)胞作為靶細(xì)胞按45×104/mL加入6孔板中4孔(A、B、C、D)，12h后按效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1加入CIK細(xì)胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA試劑測(cè)蛋白含量。等量蛋白質(zhì)采用120 g/L十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液4 ℃封閉過(guò)夜，加入兔抗人Caspase-3抗體(1∶200)，室溫孵育2 h，室溫下洗膜后加入相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)羊抗兔2抗，室溫孵育1 h，ECL顯影。以β-actin條帶作為內(nèi)對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞增殖及免疫表型檢測(cè)

2.1.1細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)觀察 見(jiàn)圖1，CIK細(xì)胞在第1～7天增殖比較緩慢，第7天以后增殖速度加快，第14天細(xì)胞增殖約100倍，細(xì)胞數(shù)為(9 611±961)×106個(gè)。細(xì)胞活率保持在97%以上。

圖1 CIK細(xì)胞增殖情況

2.1.2CIK細(xì)胞免疫表型變化 見(jiàn)圖2，CD3+CD8+及CD3+CD56+的比例隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增高。培養(yǎng)第14天時(shí)，CD3+CD8+和CD3+CD56+比例分別達(dá)到(71.37±3.68)%和(23.93±4.20)%。

圖2 CIK細(xì)胞免疫表型變化

2.1.3CIK細(xì)胞活化情況 見(jiàn)圖3，T細(xì)胞活化標(biāo)志HLA-DR的表達(dá)率隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增高。培養(yǎng)第14 d時(shí)，T細(xì)胞活化標(biāo)志HLA-DR的表達(dá)率達(dá)到93.45%，已具備活化的淋巴細(xì)胞功能。

圖3 CIK細(xì)胞活化情況

2.2MTT法檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)HEP-G2細(xì)胞殺傷活性 CIK細(xì)胞在體外對(duì)肝癌細(xì)胞株HEP-G2具有殺傷作用，并且隨著CIK細(xì)胞劑量及作用時(shí)間的增加，殺傷率增加(P<0.05)。效靶細(xì)胞作用24 h時(shí)，效靶比20∶1殺傷率與效靶比10∶1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。效靶細(xì)胞作用48 h時(shí)，效靶比20∶1殺傷率與效靶比10∶1差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。效靶細(xì)胞作用72 h時(shí)，效靶比20∶1殺傷率與效靶比10∶1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同效靶細(xì)胞作用一定時(shí)間的殺傷率

注：與1∶1比較，△P<0.05，▲P<0.01；與2.5∶1比較，○P<0.05，●P<0.01；與5∶1比較，☆P<0.05，★P<0.01；與10∶1比較，◆P<0.01。與24 h比較，*P<0.05，&P<0.01；與48 h比較，#P<0.05。

2.3JC-1熒光染色檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)HEP-G2細(xì)胞殺傷活性 圖4是不同效靶比的JC-1熒光圖。如圖所示：效靶比1∶1、5∶1、10∶1、20∶1作用24 h后，利用JC-1熒光染色檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)HEP-G2細(xì)胞殺傷活性，綠色熒光表示HEP-G2細(xì)胞已經(jīng)處于早期凋亡。

2.4Western blot法檢測(cè)肝癌細(xì)胞株HEP-G2中Caspase-3蛋白的表達(dá) 見(jiàn)表2，效靶比為1∶1時(shí)，凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)高于效靶比5∶1(P<0.05)。效靶比為20∶1、10∶1時(shí)，凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)均高于效靶比5∶1、1∶1(P<0.05)。見(jiàn)圖5，與CIK細(xì)胞共孵育的HEP-G2細(xì)胞在32 kD處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，與所染Caspase-3一抗目的蛋白分子量相同。

表2 Caspase-3蛋白與β-actin總灰度值及不同效靶比組蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

注：與1∶1比較，*P<0.05。與5∶1比較，#P<0.05。

圖5 不同效靶比組Caspase-3蛋白的表達(dá)膠片

3 討 論

CIK細(xì)胞(多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)同時(shí)表達(dá)CD3+CD56+CD8+膜蛋白分子，又稱(chēng)為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)；具有廣譜腫瘤殺傷性，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)強(qiáng)大的殺傷活性，對(duì)多重耐藥腫瘤細(xì)胞也具有殺傷活性，更加安全可靠、無(wú)毒副作用[4-6]。本研究培養(yǎng)的CIK細(xì)胞，經(jīng)過(guò)14 d的擴(kuò)增培養(yǎng)后，CD3+CD8+細(xì)胞比例提高2.24倍，CD3+CD56+細(xì)胞比例提高5.12倍，活化T細(xì)胞比例提高10.11倍，達(dá)到93.45%。表明培養(yǎng)細(xì)胞具備典型CIK細(xì)胞表型，并高度活化。

本研究結(jié)果顯示：(1)效靶細(xì)胞作用相同時(shí)間時(shí)，效靶比20∶1組與其它效靶比組相比，CIK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株HEP-G2有明顯殺傷作用。(2)效靶細(xì)胞作用48 h時(shí)，效靶比20∶1組與效靶比10∶1組在CIK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株HEP-G2的殺傷率上有差異。但作用24 h時(shí)，效靶比20∶1組與效靶比10∶1組殺傷率卻未發(fā)現(xiàn)差異。這是因?yàn)樾О屑?xì)胞作用24 h時(shí)，CIK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞株HEP-G2作用時(shí)間不足，殺傷作用不能完全體現(xiàn)。效靶細(xì)胞作用72h時(shí)，效靶比20∶1組與效靶比10∶1組殺傷率同樣未發(fā)現(xiàn)差異。這是因?yàn)镃IK細(xì)胞、肝癌細(xì)胞株HEP-G2消耗培養(yǎng)基及細(xì)胞自身的凋亡，使得此時(shí)的殺傷率較效靶細(xì)胞作用48 h時(shí)的殺傷率增加幅度不大。此結(jié)果間接驗(yàn)證了臨床回輸CIK細(xì)胞到人體的時(shí)間即間隔48 h回輸人體，1周為1療程。本研究還顯示，效靶細(xì)胞互相作用24 h后，當(dāng)效靶比為1∶1時(shí)，JC-1熒光染色檢測(cè)到肝癌細(xì)胞株HEP-G2剩余的細(xì)胞數(shù)量最多，且肝癌細(xì)胞株HEP-G2呈紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量均明顯多于其他效靶比組。當(dāng)效靶比為20∶1時(shí)，肝癌細(xì)胞株HEP-G2剩余的細(xì)胞數(shù)量最少。

CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的機(jī)制并不十分明確，目前公認(rèn)的：(1)CIK細(xì)胞釋放胞漿顆粒進(jìn)入肝癌細(xì)胞外間隔，通過(guò)顆粒內(nèi)含物發(fā)揮對(duì)靶細(xì)胞的直接殺傷作用。(2)CIK細(xì)胞可以釋放大量炎性細(xì)胞因子如IL-4、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-a等，這些細(xì)胞因子不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性間接殺傷腫瘤細(xì)胞[7]。(3)CIK細(xì)胞高水平表達(dá)Bcl-2、Bcl-xL、DADI、survivin等抗凋亡基因，這些基因共同導(dǎo)致CIK細(xì)胞可以耐受表達(dá)FasL(CD178)的肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡。CIK細(xì)胞也可以通過(guò)Fas/FasL途徑誘導(dǎo)凋亡機(jī)制，從而對(duì)其進(jìn)行有效的殺傷[8]。Fas(CD95)作為一種普遍表達(dá)的受體分子，可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞表面。FasL的大量表達(dá)只見(jiàn)于活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞。Fas和FasL的配接以三聚體的形式出現(xiàn)。3個(gè)Fas分子胞內(nèi)段所帶有的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)相聚成簇，招募了胞漿中另一種帶有死亡結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白(FADD)。FADD以其DED(死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域)連接另一個(gè)帶有DED的后續(xù)成分稱(chēng)為Caspase8前體。Caspase8前體屬于酶原，激活后稱(chēng)為Caspase8。Caspase8使Caspase3酶原轉(zhuǎn)化為具有活性的Caspase3，從而引發(fā)Caspase介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，CIK細(xì)胞、HEP-G2細(xì)胞按照效靶比20∶1、10∶1、5∶1、1∶1在互相作用24 h后，均有凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)。其中，效靶比為20∶1、10∶1時(shí)，凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)均明顯高于效靶比5∶1、1∶1，表明在殺傷過(guò)程中CIK細(xì)胞的增加能導(dǎo)致凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)增多，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。但效靶比為1∶1(24 h)時(shí)，凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)高于效靶比5∶1。因此考慮效靶比5∶1比效靶比1∶1消耗的培養(yǎng)基相對(duì)較多，而效靶比5∶1組中的CIK細(xì)胞數(shù)量少于效靶比20∶1、10∶1組中的CIK細(xì)胞數(shù)量，故效靶比5∶1組中的CIK細(xì)胞既消耗了培養(yǎng)基、數(shù)量又不足，所以不能有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HEP-G2的凋亡。

綜上，CIK細(xì)胞在體外對(duì)肝癌細(xì)胞株HEP-G2有明顯殺傷作用。殺傷機(jī)制有可能是通過(guò)Fas/FasL凋亡途徑，啟動(dòng)凋亡蛋白Caspase介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)下游凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，從而引起肝癌細(xì)胞株HEP-G2的凋亡。