王幫香，李林輝

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637002)

隨著食品行業(yè)的發(fā)展，排放在廢水中的食用油脂含量日益增高，加劇了環(huán)境污染等問題[1-2]。我國對含油污水的生物處理方法主要是活性污泥法，但是存在能力低、效果差等缺點[3]。因此，基于微生物能利用油脂作為生長所需要的碳源和能源的原理處理油脂污水的研究不斷增多[4-5]。目前國內(nèi)外研究油脂分解菌的較多，研究進展顯著，但很少從油杉等天然物質(zhì)中提取野生菌種，而且相關(guān)文章對其所研究菌株的油脂降解能力并未做具體測試。油脂降解菌類的研究仍處于初級階段，其解脂能力測定及應(yīng)用價值還有待進一步開發(fā)。研究油脂降解菌可以對油脂類污染水體進行處理，改善環(huán)境、為環(huán)保事業(yè)提供研究科學(xué)依據(jù)與參考。本文以國內(nèi)外研究的空白點為出發(fā)點，從油杉樹生長的土壤中篩選出可以高效分解油脂的菌株，對其做酶活力測試，并對該菌進行鑒定，測其種屬及分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 菌種采集自南充市金城山的松樹油脂。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、初篩培養(yǎng)基及復(fù)篩培養(yǎng)基參考《高效油脂降解菌株的篩選及特性研究》[5]略作改動，文中所用橄欖油換為菜籽油(5.0g/L)。

1.1.3 16S rDNA擴增引物及體系[6]

1.2 方法

1.2.1 菌種的篩選 對采集到的野生菌種進行富集培養(yǎng)、菌種分離、菌株初篩及復(fù)篩[5]。

1.2.2 鑒定

1.2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 在培養(yǎng)基上觀察菌株的菌落特征[7]。

1.2.2.2 生理生化鑒定 對篩選出的菌株進行革蘭氏染色[8]，并進行糖發(fā)酵試驗、V-P試驗、甲基紅試驗、淀粉水解試驗、纖維素實驗及耐鹽實驗[8-9]。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 運用試劑盒提取分離菌的DNA并進行PCR擴增[6,10]。擴增后的16S rDNA進行瓊脂糖電泳檢測后由上海生工生物工程公司測序，將測得的序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行序列比對，確定該菌的分類地位[9]。

1.2.4 構(gòu)建16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹 將測序的結(jié)果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列同源性分析及多序列比較，構(gòu)建16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。

1.2.5 分離菌解脂能力測定 用堿滴定法測定菌株的脂肪酶活力[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及生理生化實驗鑒定結(jié)果

菌落光滑呈圓形，濕潤，表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，不透明，乳白色，大小約2mm。菌株為桿菌切為弧菌，菌體較小，100倍鏡下基本看不見鞭毛芽孢等微小結(jié)構(gòu)。革蘭氏染色呈現(xiàn)紫色，糖發(fā)酵試驗、V-P試驗等實驗結(jié)果見表1。

表1 菌體生化鑒定結(jié)果

根據(jù)以上實驗結(jié)果，結(jié)合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]及《伯杰細菌鑒定手冊》[9]，初步鑒定該分離菌為芽胞桿菌屬。

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

擴增片段經(jīng)測序，測得其長度為1450bp。序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，結(jié)果顯示該菌株與蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus同源性達到99%。據(jù)此，可以判斷該分離菌為蠟樣芽胞桿菌。

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

選取16株Bacillus的其它菌株基因序列進行多序列比對，并構(gòu)建同源進化樹，如圖1所示。

圖1 芽胞桿菌屬部分物種系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 解脂能力測定結(jié)果

測定菌株的脂肪酶活力后，得到一株具有良好解脂能力的野生天然油脂分解菌，其酶活力為1.28UmL-1。

3 討論

本次研究從松樹油脂中經(jīng)富集、分離和篩選得到一株高效油脂分解菌，對其進行形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，最終確定該菌分類學(xué)地位為蠟樣芽胞桿菌。該菌表面粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀，對酸堿鹽的耐受性都很強，由此可知該菌對生存環(huán)境的適應(yīng)性很強，能在較惡劣的環(huán)境生存、繁衍。此外，經(jīng)測定該菌的脂肪酶活力為1.28U/mL，具有良好的解脂能力。 目前國內(nèi)外關(guān)于油脂分解菌的研究不少，現(xiàn)階段已研究發(fā)表的油脂分解菌類主要有葡萄球菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌屬等[12]，但大多是從廢水中提取菌種，很少從油杉等天然物質(zhì)中提取野生菌種，此類研究相對缺乏，而且相關(guān)研究對其菌株的油脂降解能力并未進行具體測試。本文的油脂降解菌是從天然的野生物質(zhì)中提取得到，并對其解脂能力進行了測試，而且根據(jù)特征確定了其分類學(xué)地位。大力開發(fā)微生物制劑處理污水，在本研究的基礎(chǔ)上對該菌的擴大培養(yǎng)做進一步的開發(fā)，并對其生長環(huán)境進行進一步探索是未來將要完成的內(nèi)容。