范勇，王蘭，張左兵

山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006

胃腸道在動物體內(nèi)擁有巨大的表面積，各種病原體通過腸道進入動物體內(nèi)可引起腸道免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護性免疫，然而當動物在受到某種外部環(huán)境因素的影響后，入侵的病原體可能會破壞腸道免疫穩(wěn)態(tài)，從而導致炎性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的發(fā)生[1-2]。IBD 包括克羅恩?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC），它們分別與輔助性 T 細胞（helper T cell，Th）Th1 和 Th2 有關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)，CD 和 UC的發(fā)病機制也和Th17 細胞有重要關(guān)系[2-6]。在臨床實驗中發(fā)現(xiàn)CD 患者體內(nèi)表達高水平的白細胞介素（interleukin，IL）17[7-8]。Th17 細胞可以產(chǎn)生IL-21，并且IL-21 通過自分泌的方式促進Th17 細胞分化[9-10]。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，人IL-2、IL-21 位點多態(tài)性與 UC 和 CD 有關(guān)[11]。研究表明，與健康人相比，乳糜瀉和UC 患者外周血和腸道中IL-21的含量有所增加[12]。通過葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導建立的IL-21-/-小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中，IL-17的表達降低，說明IL-21 對腸道炎癥有一定的促進作用[13]。IL-21可通過與腸固有層成纖維細胞和上皮細胞的IL-21 受體（IL-21R）結(jié)合，使結(jié)腸成纖維細胞誘導基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1 和MMP3的分泌，從而導致IBD 中細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解和黏膜組織損傷[10]。

IL-21 是具有4 個α螺旋的Ⅰ型細胞因子家族成員[14]，雖然可由多種CD4+T 細胞產(chǎn)生，但主要是由濾泡輔助性T 細胞（follicular helper T cell，Tfh）和 Th17 細胞產(chǎn)生[15]。中華鱉（Pelodiscus si?nensis）在動物分類地位上屬于脊椎動物門、脊索動物亞門、爬行綱、無孔亞綱、龜鱉目、曲頸龜亞門、鱉科，具有很高的食用和藥用價值，是我國當前最重要的淡水養(yǎng)殖品種之一[16]，廣泛分布在我國各地區(qū)。但近年來發(fā)現(xiàn)在中華鱉養(yǎng)殖過程中會出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，且很多個體的主要解剖癥狀為腸道出血[17]。雖然IL-21 在很多文獻中被證明和腸道炎癥有關(guān)，但有關(guān)中華鱉IL-21的信息尚無。因此，克隆中華鱉IL-21基因cDNA 并進行相關(guān)生物信息學分析，對于爬行類動物免疫和我國中華鱉疾病防治，尤其是腸道炎癥的防治有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

中華鱉購自河北省玉田縣中華鱉良種場，體重500～750 g，于（25±1）℃水中馴化 2 周，期間每日喂食1 次并換水。取樣時采用斷頭處死法，分離脾臟、肝臟、腸道等組織，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆肹18]。

1.2 cDNA第一鏈及IL-21cDNA的克隆

脾臟、肝臟和腸道組織樣品中分別加入1 mL TRIzol（Invitrogen 公司），提取總 RNA[19]，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。用SMARTer RACE cDNA 擴增試劑盒（TaKaRa 公司）合成3'-、5'-RACE-ready cDNA 文庫[18]。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中人（Homo sapiens）（NM_021803）、原雞（Gallus gallus）（NM_001024835）IL-21mRNA 序列，并依據(jù)共線性關(guān)系，在ENSEMBL 數(shù)據(jù)庫中找到中華鱉對應位置的基因組序列，用GENSCAN（http://genes.mit.edu/GENSCAN.html）在線軟件進行預測，將預測片段和火雞（Meleagris gallopavo，XM_003205701） 、爪蟾（Xenopus tropicalis，NM_001127059）IL-21cDNA 序列進行同源序列比對，在保守區(qū)域設(shè)計中華鱉IL-21cDNA RACE 引物，由上海生工公司合成（表1）,巢式PCR 反應擴增IL-21的3'與5'端片段。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測后，切膠回收相應的目的片段，克隆到 pMD19-T simple 載體（TaKaRa 公司）上，經(jīng)轉(zhuǎn)化和菌落PCR 驗證，篩選陽性克隆送上海生工公司測序，將測序結(jié)果進行BLAST 比對并拼接全長，并且進行全長克隆，測序驗證后獲得cDNA序列[18]。

1.3 生物信息學分析

用BioEdit 7.2.3 軟件對中華鱉IL-21cDNA 片段進行拼接和分析，在ENSEMBL 數(shù)據(jù)庫中搜索得到多種脊椎動物共線性關(guān)系并做圖分析。中華鱉和其他脊椎動物的氨基酸序列多重比對采用ClustalX 1.8 軟件結(jié)合BoxShade 在線軟件完成，進化樹構(gòu)建用MEGA 6.06 軟件完成，涉及的其他物種的氨基酸序列均來自GenBank 數(shù)據(jù)庫。采用SOPMA 在線軟件預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，同時利用SMART 在線軟件預測蛋白三級結(jié)構(gòu)。蛋白3D 結(jié)構(gòu)預測采用同源建模法，用SWISS-MODEL 在線軟件完成。

表1 引物序列及用途

2 結(jié)果

2.1 中華鱉IL-21基因全長獲得及序列分析

通過3'和5'RACE，分別獲得了中華鱉IL-21基因的3'和5' cDNA 片段，經(jīng)全長驗證，得到約700 bp的特異性條帶（圖1）。將片段切膠回收，與pMD19T simple 載體連接，送上海生工公司測序，測序結(jié)果和NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對后確定為中華鱉IL-21cDNA 序列。序列分析表明該基因cDNA 長度為874 bp，開放讀框（ORF）長408 bp，5'非翻譯區(qū)（UTR）為 90 bp，3'UTR 為 376 bp，編碼產(chǎn)物包含135 個氨基酸殘基。利用SMART 數(shù)據(jù)庫對結(jié)構(gòu)域的檢測分析顯示，IL-21 包含一個信號肽（1～20 位氨基酸殘基）和IL-15結(jié)構(gòu)域（8～134位氨基酸殘基）（圖2）。同時發(fā)現(xiàn)人（BBA22643）、原雞（NP_001020006）和斑馬魚（ABM46913）的IL-21 蛋白也包含一個信號肽，其次原雞和美國短吻鱷（XP_019349768）中也發(fā)現(xiàn)了IL-15 結(jié)構(gòu)域，而在哺乳類和魚類中未被發(fā)現(xiàn)。

2.2 中華鱉IL-21基因結(jié)構(gòu)與共線性關(guān)系分析

通過搜索ENSEMBL 數(shù)據(jù)庫中中華鱉的基因組序列，結(jié)合克隆得到的中華鱉IL-21基因cDNA序列，獲得了該基因的結(jié)構(gòu)示意圖。對應的基因全長 5917 bp，包含 5 個外顯子、4 個內(nèi)含子，除了斑馬魚有6 個外顯子，其他物種都是5 個外顯子。圖3為中華鱉和其他幾個物種的IL-21基因的基因結(jié)構(gòu)。

圖1 中華鱉IL-21cDNA的PCR擴增

圖2 中華鱉IL-21的cDNA序列

圖3 中華鱉IL-21基因與基因組DNA結(jié)構(gòu)示意圖

根據(jù)ENSEMBL 數(shù)據(jù)庫獲得的基因相對位置信息，繪制了中華鱉及其他進化上具有代表性的脊椎動物的IL-21基因的共線性關(guān)系圖（圖4）。比較發(fā)現(xiàn)，中華鱉同與其鄰近物種的IL-21基因存在保守的共線性關(guān)系，在中華鱉、人、小鼠、原雞和爪蟾的該基因附近均可發(fā)現(xiàn)FGF2和ADAD1等基因；同時與鳥類和兩棲類相比，它們的轉(zhuǎn)錄方向相反，但與哺乳類、魚類相比，IL-21基因的編碼方向沒有變化。

2.3 中華鱉IL-21基因編碼的蛋白特征、結(jié)構(gòu)預測及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

ProtParam tool 分析證明，IL-21 相對分子質(zhì)量為16.49×103，理論等電點7.57，帶負電的氨基酸殘基有15 個，帶正電的氨基酸殘基有16 個，不穩(wěn)定系數(shù)為51.67，總平均親水性為-0.334，脂溶指數(shù)為76.69。SOPMA 在線預測結(jié)果表明，IL-21的二級結(jié)構(gòu)主要有α螺旋（59.66%）、β折疊（3.45%）、延伸鏈（7.59%）和不規(guī)則卷曲（39.31%）（圖5）。

圖4 幾種脊椎動物IL-21基因的共線性關(guān)系圖

圖5 幾種脊椎動物IL-21氨基酸序列對比

如圖6所示，中華鱉IL-21 蛋白與原雞親緣關(guān)系最近，其次是哺乳類。在SWISS-MODEL 網(wǎng)站，以人IL-21 為模型，構(gòu)建了中華鱉IL-21 蛋白的3D 模型，兩者的一致性為37.78%，中華鱉IL-21的 83～134 位殘基處多了 3 個α螺旋，23～26 位殘基處多了1 個α螺旋（圖7）。

圖6 脊椎動物IL-21氨基酸序列進化樹（鄰接法，自舉檢驗1000次）

2.4 中華鱉IL-21的相似性和一致性分析

將中華鱉與所選物種的IL-21 氨基酸序列做相似性和一致性分析，結(jié)果見表2。在所選物種中，中華鱉與原雞的IL-21的相似性（43%）、一致性（61%）最高，其次與人有較高的相似性（35%）和一致性（46%），與河豚的相似性（22%）和一致性（41%）最低。

3 討論

在人類IBD的主要形式CD 和UC 患者的腸道中，組織損傷性免疫反應是通過免疫細胞和非免疫細胞之間的活躍交叉作用介導的，IL-21 在這個過程中起重要作用[20]。我們以中華鱉為研究對象，采用SMARTer RACE 技術(shù)獲得IL-21的cDNA序列。該基因cDNA 序列的3'UTR 有2 個不穩(wěn)定信號（attta），說明該基因mRNA 半衰期短，符合細胞因子的特征[21]?；蚬簿€性分析比較了中華鱉與其他幾個物種，發(fā)現(xiàn)中華鱉IL-21與其他物種鄰近基因存在保守的共線性關(guān)系，在中華鱉、人、小鼠、原雞和爪蟾該基因附近均可發(fā)現(xiàn)FGF2和ADAD1等基因；與哺乳類和魚類相比，IL-21基因的編碼方向沒有變化，雖然與鳥類和兩棲類相比，它們的轉(zhuǎn)錄方向相反，但這可能是由于FGF2和ADAD1基因在IL-21兩側(cè)的位置顛倒造成的，這一結(jié)果提示我們獲得的基因可能是中華鱉IL-21。該基因有5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，這一特征與人、河豚和原雞的基因結(jié)構(gòu)一致，只是斑馬魚有6 個外顯子和5 個內(nèi)含子。與此同時通過構(gòu)建的進化樹還發(fā)現(xiàn)，中華鱉IL-21 首先與原雞聚類，其次是哺乳類，這就表明在進化關(guān)系上，爬行類的IL-21進化更接近鳥類[22]，這與分子水平上關(guān)于中華鱉進化地位的研究一致[23]。通過氨基酸序列分析可知，該序列有信號肽，這與哺乳類、鳥類和魚類一致。此外，中華鱉IL-21 蛋白有IL-15 結(jié)構(gòu)域，而在哺乳類和魚類中未發(fā)現(xiàn)，其他爬行類和鳥類有IL-15 結(jié)構(gòu)域，這可能也提示中華鱉IL-21 蛋白與鳥類IL-21 蛋白在功能上比較接近。半胱氨酸對于二硫鍵的形成非常重要[24-25]，氨基酸多重序列比對表明半胱氨酸在哺乳動物、魚類、爬行類和鳥類IL-21 中非常保守，提示IL-21的功能可能較為保守。采用同源建模法，以人IL-21為模型預測了中華鱉IL-21 蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，兩者的一致性為37.78%，中華鱉83～134 位氨基酸殘基處（螺旋C）多3 個α螺旋，23～26 殘基處（螺旋A）多1 個α螺旋，研究表明IL-21 和IL-21Rα之間的相互作用主要由螺旋A 和C 以及IL-21 螺旋C 后的CD 環(huán)介導；與γC 受體之間的相互作用主要由螺旋 A 和 D 以及 IL-21 螺旋 C 后的 CD 環(huán)介導，中華鱉和人的IL-21 三維結(jié)構(gòu)上的差異提示它們在受體結(jié)合能力或功能上可能存在一定程度的差異[26]。而比較人和小鼠的IL-21 蛋白模型，兩者的一致性為56%，也說明該蛋白在一級結(jié)構(gòu)上保守性不強，符合細胞因子的特征，由于免疫系統(tǒng)在進化過程中受到的選擇壓力比較大，進化速率較快，因此不同物種間的細胞因子在序列間相差較大[27]。

圖7 中華鱉和人IL-21蛋白3D模型

表2 中華鱉與其他物種IL-21的相似性和一致性分析

綜上，我們克隆了中華鱉IL-21基因cDNA 序列，分析了其基因及蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了它在進化地位上更接近哺乳類和鳥類。這為中華鱉IL-21基因的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)，對爬行動物先天性免疫研究和中華鱉疾病防治尤其是腸炎癥的治療有重要意義。