童康梅 郭國棟 黃海建 陳小巖

甲狀腺疾病是臨床中的常見病和多發(fā)病，治療主要采用手術(shù)切除。一般均要求進(jìn)行術(shù)中快速冷凍病理診斷，以確定腫瘤性質(zhì)，有利于決定手術(shù)方式和手術(shù)范圍，也可使患者免受二次手術(shù)的痛苦[1-3]?？焖俨±碓\斷要求時(shí)間短、診斷準(zhǔn)確，冷凍切片是術(shù)中快速病理診斷的主要方法，冷凍切片技術(shù)在病理診斷中具有舉足輕重的作用[4-6]，冷凍切片的質(zhì)量將影響病理診斷的快速性和診斷性。甲狀腺組織結(jié)構(gòu)特殊，而影響甲狀腺冷凍切片質(zhì)量的因素眾多，如取材，冷凍時(shí)間與溫度，固定液，切片技術(shù)等，其中固定液的選擇至關(guān)重要。下面選取4種不同的固定液來進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，通過HE染色觀察4種固定液對甲狀腺冷凍切片的固定效果，從而篩選出一種甲狀腺冷凍切片的最佳固定液。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

福建省立醫(yī)院南院病理科2017年5月—2018年5月新鮮甲狀腺手術(shù)切除標(biāo)本30例。

1.2 儀器及試劑

徠卡CM1950-1冷凍切片機(jī)，包埋劑OCT，Thermo MX35型一次性刀片，蘇木精染液，1%鹽酸乙醇分化液，0.5%氨水返藍(lán)液，1%醇溶性伊紅，各濃度梯度乙醇，二甲苯，中性樹膠。

1.3 固定液

（1）95%乙醇；（2）10%中性緩沖福爾馬林固定液；（3）AF液：95%乙醇90 mL，甲醛10 mL混合固定液；（4）AFA液：95%乙醇85 mL，甲醛10 mL，冰醋酸5 mL混合固定液。

1.4 方法

將徠卡CM1950-1冷凍切片機(jī)箱體溫度設(shè)置為-18℃，冷凍切片機(jī)機(jī)頭溫度設(shè)置為-15℃，切片厚度6 μm，提前開啟PE速凍臺(tái)。送檢新鮮甲狀腺標(biāo)本，規(guī)范取材，用濾紙將組織表面的血性液體吸干，然后將組織放入提前制備的OCT冰托上，再加蓋少量包埋劑，用冷凍錘輕輕壓平。粗修暴露最大面，然后6 μm厚連續(xù)切片4張，平整地吸附于潔凈的載玻片上，分別迅速放入已準(zhǔn)備好的4種固定液中固定1 min，稍水洗，入蘇木素染色1 min，水洗；1%鹽酸乙醇分化2 s，稍水洗；0.5%氨水返藍(lán)，稍水洗；75%乙醇10 s，醇溶性伊紅10 s，梯度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結(jié)果

經(jīng)10%中性福爾馬林固定的冷凍切片，組織結(jié)構(gòu)模糊，核質(zhì)對比度差，核固縮，核染色模糊，大部分膠質(zhì)脫落（如圖①、圖⑤）。經(jīng)95%乙醇固定的冷凍切片染色效果一般。組織結(jié)構(gòu)尚清晰，核質(zhì)對比度一般，胞核染色不佳，核明顯收縮，濾泡膠質(zhì)部分著色，部分膠質(zhì)濾泡缺失（如圖②、圖⑥）。經(jīng)AF液固定的冷凍切片，組織結(jié)構(gòu)較清晰，核質(zhì)對比度一般，核輕微收縮，膠質(zhì)濾泡幾乎全部著色（如圖③、圖⑦）。經(jīng)AFA液固定的冷凍切片染色效果最好。組織結(jié)構(gòu)清晰，顏色鮮艷，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡粉色，細(xì)胞形態(tài)清晰，核質(zhì)對比度良好，濾泡膠質(zhì)全部著色，鏡下最接近石蠟切片HE染色（如圖④、圖⑧）。具體詳見圖1。4種固定液對甲狀腺冷凍切片固定效果的比較，詳見表1。

表1 4種固定液對甲狀腺冷凍切片固定效果的比較

圖1 4種固定液對甲狀腺冷凍切片效果的顯微攝影比較

3 討論

固定液具有滲透、殺死細(xì)胞及其微生物和固化組織等作用，是保存組織器官用于病理診斷所必需的過程；固定液保持離體組織細(xì)胞與生活時(shí)的形態(tài)相似，抑制組織自溶及細(xì)菌繁殖所致的腐爛；使細(xì)胞內(nèi)一些蛋白質(zhì)等可沉淀或凝固，使其定位在細(xì)胞內(nèi)的原有部位，有利于固定后物質(zhì)的確切定位；保持細(xì)胞內(nèi)組織抗原、DNA、RNA，便于進(jìn)一步的特殊檢查；有利于染色反應(yīng)，便于光鏡下對細(xì)胞內(nèi)不同成分進(jìn)行區(qū)別[7]。甲狀腺實(shí)質(zhì)由大量甲狀腺濾泡和濾泡旁細(xì)胞組成，濾泡間有少量結(jié)締組織和豐富的毛細(xì)血管；甲狀腺濾泡腔內(nèi)充滿透明的膠質(zhì)，膠質(zhì)是濾泡上皮細(xì)胞的分泌物，即碘化的甲狀腺球蛋白，在切片上呈均質(zhì)狀，嗜酸性；膠質(zhì)邊緣常見空泡，是濾泡上皮細(xì)胞吞飲膠質(zhì)所致。由于大多數(shù)甲狀腺病變形態(tài)表現(xiàn)為濾泡結(jié)構(gòu)，如甲狀腺腫、甲狀腺炎、腺瘤及甲狀腺癌等，認(rèn)識(shí)各種濾泡性病變，不僅有助于做出正確的病理診斷，而且能有機(jī)的與甲狀腺功能相聯(lián)系，全面解釋患者的臨床癥狀和體征，而選擇最佳的固定液就能最大限度地縮小冷凍切片與常規(guī)石蠟切片的差異性[8-9]。甲狀腺結(jié)構(gòu)的特殊性決定了甲狀腺在冷凍切片中對固定液選擇和染色過程中條件選擇的特殊性[10]。

甲醛為非沉淀性固定劑，不能使白蛋白和核蛋白沉淀，通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生作用[11]。甲醛水溶液滲透能力強(qiáng)，固定均勻，對組織收縮較少，10%中性福爾馬林緩沖液可以很好的保存細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也能夠較好地保存組織細(xì)胞的大多數(shù)抗原性，是一種最理想的常規(guī)固定液。但用10%中性福爾馬林緩沖液固定冷凍切片時(shí)間長，需固定10 min以上[12]，由于甲狀腺結(jié)構(gòu)的特殊性，用10%中性福爾馬林緩沖液僅短時(shí)間固定后，組織結(jié)構(gòu)模糊，核質(zhì)對比度差，核固縮，核染色模糊，膠質(zhì)脫落現(xiàn)象明顯，固不適合用于快速冰凍切片固定。

95%乙醇用于固定，對纖維蛋白和彈性纖維等固定效果好，其滲透力弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，但核蛋白經(jīng)沉淀后，能溶于水，不利于染色體的固定[11]，因此單純用乙醇固定的組織其細(xì)胞核染色不佳，細(xì)胞收縮明顯，且有膠質(zhì)脫落現(xiàn)象，不適合單獨(dú)用于快速冰凍切片的固定。

冰醋酸的穿透能力強(qiáng)，不能沉淀白蛋白、球蛋白，但能沉淀核蛋白，可較好地保存染色體的結(jié)構(gòu)，能清楚地顯示細(xì)胞核，缺點(diǎn)是組織膨脹較明顯，尤其對膠原纖維和纖維蛋白，一般很少單獨(dú)使用[12]。

AF液由95%乙醇，濃甲醛混合配制而成，甲醛固定作用均勻，組織收縮小，但不能沉淀核蛋白，與乙醇混合使用可兼有固定和脫水的作用，細(xì)胞核收縮略小，性能略優(yōu)，但不是最佳。

AFA液由95%乙醇，濃甲醛、冰醋酸混合配制而成，不僅穿透力強(qiáng)，能迅速沉淀蛋白質(zhì)，還能使細(xì)胞染色更清晰。此液中甲醛與乙醇混合兼有固定和脫水的作用，加冰醋酸后促使固定加快，穿透力強(qiáng)[7]，膨脹性強(qiáng)，可以緩沖乙醇的收縮作用，且冰醋酸能增強(qiáng)核染色的選擇性，使核漿顏色對比鮮明，加入冰醋酸不僅抵消了乙醇收縮的缺點(diǎn)，使細(xì)胞核漿染色更清晰，且冰醋酸還可以有效地防止膠質(zhì)脫落現(xiàn)象的發(fā)生[7]，濾泡膠質(zhì)幾乎全部著色。

綜上所述，AFA液固定的甲狀腺冷凍切片，固定效果好，鏡下最接近石蠟切片HE染色，有助于提高診斷的準(zhǔn)確性，所以認(rèn)為AFA液是以上四種固定液中甲狀腺組織快速冰凍切片的最佳固定液之一。