曾長立，于 真，戴希剛，丁建軍

（江漢大學 a.生命科學學院，湖北豆類（蔬菜）植物工程技術研究中心；b.科研處，湖北 武漢 430056）

藜蒿，又名蔞蒿、蘆蒿、柳蒿、水蒿、香艾、小艾、水艾，屬菊科蒿屬，其原為野生植物，多分布于堤淺灘洲的潮濕地區(qū)，適應性好，抗逆性強。全草具有特殊香氣，可藥食兩用［1］。藜蒿具有祛風濕、健脾胃、化痰、促消化、降血壓血脂、緩解心血管疾病等食療作用。近年來，人們對藜蒿中的化學成分和藥理作用等表現出較大的興趣［2］，但目前對藜蒿茶的研究甚少。藜蒿茶是新鮮藜蒿經特定加工工藝制成的茶葉。藜蒿茶開水沖泡片刻即可飲用，它有效延長了藜蒿的食用周期，大大提高了藜蒿的應用范圍，使藜蒿更加便捷、高效地發(fā)揮價值。有研究表明，蒿屬植物中的某些有機化合物如黃酮類化合物等具有抗病原微生物活性與抗炎活性［3］。茭蒿（Artemisia giraldii）中的4′，6，7-三羥基-3′，5′-二甲氧基黃酮和5′，5- 二羥基-3′，4′，8-三甲氧基黃酮對金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、變形桿菌屬某些種，以及黃曲霉、綠色木霉等均有明顯的抑制作用［4］；艾蒿葉的水浸劑對常見致病性皮膚真菌有抑制作用［5］，艾葉提取物通過有效抑菌作用而延長黃瓜貯藏期［6］，研究揭示艾葉揮發(fā)油主要成分為α-松油醇、β-桉葉精、α-側柏酮、β-丁香烯、莰烯、樟腦、藏茴香酮和反式葦醇等，是艾葉抗菌的重要活性成分［7-8］。武月紅［9］以黃花蒿、艾蒿、茵陳蒿、大籽蒿、蒙古蒿、林地蒿6 種菊科蒿屬植物的乙醇提取物為材料進行試驗，結果表明其對丁香假單胞菌、根癌土壤桿菌、馬鈴薯環(huán)腐病菌均有一定的抑菌作用。在藜蒿研究中，眾多研究者證實了藜蒿葉片提取物具有一定的抑菌效果［9-12］。但目前為止，利用新鮮藜蒿葉片通過成茶工藝加工成的藜蒿茶是否具有抑菌效果還未見報道。因此，筆者通過正交試驗設計醇提和水提方法，以藜蒿茶浸提液抑菌效果為評價值，研究最高抑菌效果浸提液的浸提條件，以期為藜蒿茶的保健功能研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中的藜蒿茶材料由恩施州聰霖有限公司提供，采用藜蒿嫩葉加工制作而成；供試菌種為大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、產氣桿菌、普通變形桿菌6 種。

1.2 正交設計

分別稱取5 g 藜蒿茶以1∶10 料液比，按照以下浸提條件獲得浸提液。1.2.1 醇提正交試驗的設計 根據正交試驗設計原理，綜合單因素預試驗結果，選取乙醇溶液體積分數（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）作為影響乙醇浸提藜蒿茶浸提液抑菌效果的影響因素，在單因素試驗基礎上采用L9（34）3 因素3 水平的正交試驗法，試驗因素與水平設計見表1。為防止高濃度乙醇溶液揮發(fā)，部分試驗采用索氏抽提器（密閉性內循環(huán)）進行。

表1 正交試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.2 水提試驗的設計 水提試驗分為兩組，第一組：鑒于日常多用沸水沖泡茶葉，遂第一組均用沸水分別浸提1、2、4、6 h；第二組：在第一組基礎上，分別用65、75、85、95 ℃蒸餾水浸提。為保持溫度，試驗在水浴鍋內進行。

1.3 方法及最小抑菌濃度的測定

根據1.2.1 和1.2.2 獲得藜蒿茶浸提液，備用。在無菌超凈工作臺上，將上述6 種供試菌種用適宜斜面活化，用高壓滅菌過的生理鹽水配制成104 ～106 CFU/mL 的菌懸液。將各種待試菌懸液吸取0.1 mL于已備好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面上，涂抹均勻，放置于（37 ± 1）℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥15 min。培養(yǎng)基均已做無菌檢查，待瓊脂完全凝固后，將其轉移至恒溫培養(yǎng)箱中，在37 ℃的條件下培養(yǎng)24 ～48 h?？从袩o雜菌生長，若無即可使用。

采用濾紙片法測定抑菌作用，取直徑6 mm 的滅菌濾紙片（高壓滅菌，120 ℃烤干），放入浸提液中浸泡48 h。取出培養(yǎng)皿，用無菌鑷子夾取濾紙片置于培養(yǎng)皿中，每皿4 片，其中3 片試驗樣品呈等邊三角形排列，中間放置1 片空白濾紙片作陰性對照，每種菌做兩組平行試驗。蓋好培養(yǎng)皿，置于（37±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h。用游標卡尺精準測量抑菌環(huán)的直徑（包含濾紙片）并記錄，每張濾紙片垂直測定兩次，取平均值，平行組試驗排除特異項后取平均值，以此作為其抑菌效果的評價標準。

最小抑菌濃度（MIC）的測定：用無菌水將1.2.1 與1.2.2 中適宜條件下獲得的浸提液稀釋成若干梯度，用滅菌移液槍吸取1 mL 稀釋樣液于無菌培養(yǎng)皿中，倒入培養(yǎng)基混勻，再各吸取0.1 mL 各種供試菌菌懸液于培養(yǎng)皿表面，用涂布棒均勻涂布，蓋好培養(yǎng)皿，置于（37 ± 1）℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h。以完全無菌生長的濃度為最低抑菌濃度。以無菌生理鹽水做空白對照。

2 結果與分析

2.1 醇提正交試驗

乙醇提取藜蒿茶浸提液抑菌試驗結果見表2。從表2 可知，不同水平組合下，抑菌環(huán)的大小存在明顯差異。對于大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、產氣桿菌與普通變形桿菌而言，A3B3C2組合的抑菌環(huán)分別達到最大；而A1B1C1組合對金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌的抑菌環(huán)分別為最大。

表2 醇提抑菌正交試驗結果Tab.2 Bacteriostatic results of orthogonal experiment of ethanol extract

對上述結果用DPS 軟件進行正交試驗方差分析，分析結果（表3）表明，因素A（乙醇體積分數）、因素B（浸提溫度）的P值均小于0.001，說明乙醇體積分數和浸提溫度對藜蒿茶抑菌效果達到極顯著性影響；而因素C（浸提時間）的P值處于0.01 ～0.05 之間，說明浸提時間的長短對藜蒿茶浸提液抑菌效果也有顯著性影響。各因素對抑菌效果的影響大小依次排列為B＞A＞C。

表3 正交設計方差分析Tab.3 Orthogonal design ANOVA

進一步對上述結果進行LSD 多重比較分析，結果表明，A3B3C2水平組合獲得的浸提液抑菌效果最佳（表4），即90%乙醇溶液在95 ℃溫度下浸提75 min 所得浸提液的抑菌效果最好。

表4 LSD 法多重比較Tab.4 Multiple comparison by LSD

2.2 水提試驗結果

藜蒿茶葉在1、2、4、6 h 這4 個時間段內用蒸餾水浸提所得浸提液的抑菌環(huán)直徑變化趨勢見圖1。結果顯示，在1、2、4 h 3 個浸泡時間段內存在抑菌效果，在2 ～4 h 的時間段內抑菌效果略有下降，4 ～6 h 的時間段內抑菌效果顯著下降，浸泡6 h 就不再有抑菌現象出現?？梢姡诮輹r間不到2 h，抑菌效果隨時間的增加逐漸增強。2 h 之后抑菌效果隨時間的增加逐漸減弱，直至消失，故確定水提試驗采用2 h 的浸泡時間。

圖1 不同水提時間抑菌環(huán)直徑變化趨勢圖Fig.1 Trend of diameter of bacteriostatic ring with different water extraction time

藜蒿茶葉在65、75、85、95 ℃4 個溫度梯度下用蒸餾水浸提2 h 所得浸提液的抑菌環(huán)直徑變化趨勢見圖2。結果顯示，65、75 ℃下浸提液無抑菌現象。85、95 ℃下對6 種菌均有抑菌現象，且85 ℃下抑菌環(huán)直徑較大，95 ℃下抑菌效果顯著下降。可見，85 ℃的溫度能夠更好地提取出藜蒿茶葉中的抑菌物質，而95℃的溫度過高，可能導致效應物揮發(fā)，故確定水提試驗采用85 ℃的溫度浸泡。

以上試驗的空白對照均是以蒸餾水代替藜蒿浸提液作為對照，其他條件不變?？瞻捉M抑菌環(huán)不明顯（ΦA≤7 mm），可以忽略不計。

圖2 不同水提溫度抑菌環(huán)直徑變化趨勢圖Fig.2 Trend of diameter of bacteriostatic ring with different water extraction temperature

2.3 藜蒿茶浸提液最小抑菌濃度

通過抑菌環(huán)試驗，無論藜蒿茶水提液還是醇提液均對各供試菌有良好的抑制效果。為了進一步說明抑制作用和對各菌種最小抑菌的差異，采取最小抑菌濃度試驗法，結果見表5。此結果與上述研究結果一致，藜蒿茶提取液對6 種供試菌均具有抑制效果。由表5 可知，對于最小抑菌濃度（MIC），藜蒿茶水提液對銅綠假單胞菌的MIC 最大，藜蒿茶醇提液對枯草芽孢桿菌的MIC 最大；2 種浸提液對大腸埃希菌的最小抑菌濃度最低，說明藜蒿茶浸提液對大腸埃希菌的生長有很好的抑制作用，抑制效果高于對其他菌種。藜蒿茶醇提液的最小抑菌濃度普遍小于水提液，可能原因是醇提液浸提的關鍵化學成分含量更高，而且乙醇自身也具備抑菌作用所致。

表5 藜蒿茶浸提液對各供試菌種的最小抑菌濃度Tab.5 Minimal bacteriostatic concentration of extract of Artemisia selengensis tea to various strains

3 討論

對野生植物藜蒿抑菌作用的研究已有報道，藜蒿原莖葉汁及其水浸提液對巨大芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等有抑制作用［13］，而且對一些腸道菌如痢疾桿菌、大腸埃希菌等在體外也有較好的抑制作用。因此，藜蒿具有潛在抑菌產品開發(fā)的價值［14］。本研究中無論醇提或水提獲得的藜蒿茶浸提液對6 種試驗菌種均存在抑制效果，此與以前的研究結果基本一致［12］。供試菌種包含革蘭陽性菌和革蘭陰性菌，試驗證明其抑菌作用對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌無差異。本試驗適宜醇提條件為1∶10 料液比在95 ℃的溫度下使用90%體積分數的乙醇溶液浸提75 min，所得的藜蒿茶浸提液的抑菌效果最好。辛欣等［15］的研究表明，適宜提取條件為90%乙醇、料液比1∶10、提取溫度70 ℃、提取時間45 min，與本試驗的浸提溫度和時間選擇條件存在差異，可能是不同地域的藜蒿品種抗菌成分存在差異所致。使用蒸餾水在85 ℃的溫度下浸提2 h，所得的藜蒿茶浸提液的抑菌效果最好。進一步分析表明藜蒿茶浸提液對不同細菌均具有抑制作用，但對不同細菌的抑制效果差異并不顯著，說明其具有廣譜抑菌效果。抑菌環(huán)試驗說明藜蒿茶含有抑菌物質，據前人報道藜蒿提取物中主要抑菌作用物質為三萜化合物和倍半萜內酯等，有消炎、抑菌作用，其中已被驗證含有齊敦果酸［16］。在6 種供試菌中，藜蒿茶浸提液對大腸埃希菌的最小抑菌濃度最小，說明其對大腸埃希菌有較好的抑制作用，但其抑制作用機制及體內抑制效果有待進一步研究。