張?chǎng)╂?，于孟飛，劉貝貝，劉慶華

（中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074）

哮喘是一種以慢性氣道炎癥和可變重塑為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，影響全球3 億多患者［1］，給政府、基礎(chǔ)醫(yī)療部門(mén)、家庭、患者和護(hù)理人員帶來(lái)了巨大的負(fù)擔(dān)［2］。哮喘的癥狀包括喘息、呼吸短促、胸悶和咳嗽，其主要原因是氣道高反應(yīng)（airway hyper-responsiveness，AHR）。氣道高反應(yīng)是指非特異性刺激在正常人呈無(wú)反應(yīng)狀態(tài)或反應(yīng)程度較輕，而在某些人卻引起了明顯的支氣管狹窄，其機(jī)制尚不明確［3］。目前治療氣道高反應(yīng)的藥物主要是β2受體激動(dòng)劑，這類藥物具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如心悸、震顫、頭痛［4］、心肌梗死、充血性心力衰竭、心臟驟停和心源性猝死以及危及生命的哮喘發(fā)作［5］、脫敏［6］。因此，哮喘氣道高反應(yīng)的機(jī)制及治療方法亟待研究。

已知高K+導(dǎo)致膜去極化，激活L-型電壓依賴性Ca2+通道（L-type voltage-dependent calcium channel，LVDCC），然后介導(dǎo)Ca2+流入以引發(fā)持續(xù)收縮［7］。因此，本研究利用高K+誘發(fā)去極化導(dǎo)致收縮，離體模擬這一復(fù)雜在體過(guò)程，此方法可幫助我們快速地篩選抑制氣道平滑肌收縮的藥物。

研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸（1，8-二羥基-3-羧基蒽醌，Rhein）減少α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)［8］，抑制大鼠離體子宮平滑肌的自發(fā)收縮活動(dòng)［9］，這提示大黃酸可能對(duì)氣管平滑肌的收縮有影響。本文利用上述篩選平臺(tái)研究大黃酸抑制小鼠氣管平滑肌收縮效應(yīng)及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周齡SPF 級(jí)BALB/C♂小鼠，合格證號(hào)：42000600027283，42000600027161。購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（湖北武漢），飼養(yǎng)于中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)前7 d，小鼠自由采食，以適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 藥品與試劑 大黃酸（上海源葉生物，HPLC ≥98%，批號(hào)：T30A8F42628），氯化鈉、氯化鉀、六水合氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水氯化鈣、葡萄糖、二甲基亞砜（DMSO）等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。HEPES、硝苯地平（Nifedipine）、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶、牛血清蛋白、二硫蘇糖醇購(gòu)于美國(guó)Sig?ma-Aldrich。Fura-2，AM（Invitrogen，批號(hào)：1179866，美國(guó)）。

1.1.3 儀器 JH-2 型張力換能器（北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所），HV-4 離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)（成都泰盟），EPC-10 膜片鉗放大器（HEKA，Lambrecht，德國(guó)），TILL 成像系統(tǒng)（FEI Munich GmbH，德國(guó)），倒置顯微鏡（OLYMPUS IMAGING，日本）。

1.2 方法

1.2.1 藥物與溶液配置 取適量硝苯地平溶于DMSO 制成濃度為10 mmol/L 母液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。大黃酸溶于DMSO 配置成100 mmol/L 母液，超聲振蕩30 min 后，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｉ睇}溶液（PSS）：135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L 葡萄糖（pH = 7.40）。氣管平滑肌及其單細(xì)胞分離液：120 mmol/L NaCl，1.2 mmol/L MgCl2，0.1 mmol/L CaCl2，5.2 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，11 mmol/L 葡 萄糖，0.6 mmol/L KH2PO4，25 mmol/L NaHCO3（pH =7.10）。將木瓜蛋白酶和二硫蘇糖醇一起溶于1 g/L 牛血清蛋白中配置終濃度為2 g/L 和0.3 g/L，膠原蛋白酶溶于1 g/L 牛血清蛋白中配置終濃度為1 g/L。

1.2.2氣管環(huán)的制備 用頸部脫臼法處死小鼠，剪下氣管，去除附著組織，從氣管遠(yuǎn)端剪取4～5 mm 氣管環(huán)，用兩個(gè)三角掛鉤穿過(guò)氣管環(huán)，掛鉤上端連接張力換能器，下端固定于離體器官灌流槽的底部，將氣管環(huán)前負(fù)荷設(shè)置為3 mN。槽內(nèi)充入氧飽和的PSS，保持恒溫37 ℃，每15 min 更換一次PSS，共換液4次，完成預(yù)平衡。用80 mmol/L K+對(duì)氣管環(huán)進(jìn)行預(yù)刺激，待張力達(dá)到平臺(tái)期后，用PSS 換液，待氣管環(huán)張力達(dá)到基線，25 min 后進(jìn)行同樣的預(yù)收縮，共完成3 次，然后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 大黃酸最佳藥物濃度的確定 向灌流槽中加入不同體積的大黃酸母液，使灌流槽中的大黃酸濃度累積達(dá)到1.00、3.16、10.00、31.60、100.00、177.80 和200.00 μmol/L（以藥理學(xué)（lg（濃度，mol/L））設(shè)定濃度梯度）。對(duì)照劑是DMSO。以80 mmol/L K+引起的最大收縮為參考標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算舒張的程度。

1.2.4 氣管平滑肌細(xì)胞的分離 剪取小鼠氣管平滑肌，置入在37 ℃木瓜蛋白酶中20 min，再移入37 ℃膠原蛋白酶中7 min，然后運(yùn)用機(jī)械力將單個(gè)平滑肌細(xì)胞分離下來(lái)，置冰上備用。

1.2.5 膜片鉗記錄LVDCC 電流 以Ba2+作為電荷載體測(cè)LVDCC 電流。玻璃電極與細(xì)胞膜形成高阻抗封接，給予較高負(fù)壓破膜，形成全細(xì)胞記錄方式，將細(xì)胞鉗制在-70 mV，之后記錄LVDCC 電流。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)量 2.5 μmol/L Fura-2，AM 在灌流槽中孵育細(xì)胞20 min，然后灌流洗去多余染料。利用TILL 鈣成像系統(tǒng)采集對(duì)應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)340 nm 和380 nm 的熒光強(qiáng)度，曝光時(shí)間為50 ms，間隔時(shí)間為1 s，獲取340 nm 和380 nm 熒光強(qiáng)度的比率，用以代表細(xì)胞內(nèi)鈣水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 9.0（OriginLab，美國(guó)）進(jìn)行t-test 數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±SD）表示,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸抑制高鉀收縮

使用高鉀預(yù)先收縮了小鼠離體氣管環(huán)，待收縮達(dá)到平臺(tái)后，大黃酸被累積加入灌流槽中，氣管平滑肌的收縮被劑量依賴性地抑制（圖1A，n= 6），半抑制濃度（EC50）為（28.4 ± 3.4）μmol/L，最大舒張百分比為（92.7 ± 8.0）%，在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中未觀察到此現(xiàn)象（圖1B，n= 6）。除去大黃酸后，再次使用高鉀收縮，張力值又恢復(fù)至第一次預(yù)收縮張力值的（92.8 ± 10.7）%（n= 4），大黃酸量效曲線如圖1C 所示。此外，本研究發(fā)現(xiàn)大黃酸對(duì)靜息氣管環(huán)無(wú)影響（圖1D，n= 4）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：大黃酸抑制了高鉀誘導(dǎo)的小鼠氣管環(huán)平滑肌的收縮。

圖1 大黃酸抑制小鼠氣管環(huán)的收縮Fig.1 Inhibition effects of rhein on mouse tracheal ring contraction

2.2 大黃酸抑制收縮的機(jī)制

已知高鉀導(dǎo)致膜去極化，其激活L-型電壓依賴性Ca2+通道（LVDCC），該通道介導(dǎo)Ca2+流入引發(fā)持續(xù)收縮。因此，我們觀察了硝苯地平對(duì)高鉀收縮的影響。結(jié)果顯示高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮被硝苯地平完全抑制。最大舒張百分比為（97.3 ± 1.6）%（圖2，n= 7），表明高鉀誘導(dǎo)的收縮完全依賴于LVDCC 介導(dǎo)的Ca2+流入。

圖2 硝苯地平抑制高鉀引發(fā)的收縮Fig.2 Inhibition effects of nifedipine on contraction induced by high K+

為了確認(rèn)Ca2+流入，我們使用圖3A 所示程序記錄了LVDCC 介導(dǎo)的電流，電流被硝苯地平完全阻斷（圖3B），同時(shí)被大黃酸幾乎阻斷（圖3C），說(shuō)明大黃酸抑制LVDCC，顯而易見(jiàn)，由LVDCC 導(dǎo)致的Ca2+內(nèi)流應(yīng)該會(huì)隨之被抑制。

圖3 大黃酸抑制LVDCC 介導(dǎo)的電流Fig.3 Inhibition effects of rhein on LVDCC-mediated currents

這一推測(cè)，由細(xì)胞內(nèi)Ca2+直接測(cè)量所證實(shí)。80 mmol/L K+誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣一過(guò)性迅速升高，然后維持在一個(gè)較高的平臺(tái)水平，Ratio（340/380）為（0.44 ± 0.05），加入177.80 μmol/L 大黃酸后，平臺(tái)恢復(fù)至基線水平，Ratio（340/380）為（0.28 ± 0.02）（圖4，n= 12）。以上結(jié)果表明，大黃酸抑制LVDCC 后，Ca2+內(nèi)流停止。

圖4 大黃酸抑制氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度Fig.4 Inhibition effects of rhein on intracellular calcium concentration in tracheal smooth muscle cells

本研究進(jìn)一步在氣道平滑肌上驗(yàn)證了上述結(jié)論。高鉀在無(wú)外Ca2+條件下未引起平滑肌的收縮，當(dāng)外Ca2+濃度恢復(fù)到2 mmol/L 后，立即產(chǎn)生收縮，并被177.80 μmol/L 大黃酸抑制（見(jiàn)圖5），最大舒張百分比為（88.1 ± 2.1）%（n= 6）,揭示高鉀收縮是Ca2+內(nèi)流所致，此Ca2+內(nèi)流被大黃酸抑制，然后出現(xiàn)了平滑肌舒張。

圖5 大黃酸抑制高K+引發(fā)的鈣內(nèi)流Fig.5 Inhibition effects of rhein on calcium influx caused by high K+

3 討論

哮喘是呼吸系統(tǒng)中最常見(jiàn)的疾病之一，其基本特征是氣道平滑肌細(xì)胞的收縮異常，這種收縮異常既是哮喘癥狀又是其惡化的原因，因此抑制氣道平滑肌異常過(guò)度收縮是治療哮喘的關(guān)鍵。雖然大黃酸沒(méi)有改變靜息肌張力，但舒張了預(yù)收縮的張力。因此，本文著重闡明這一現(xiàn)象的機(jī)制。硝苯地平是LVDCC 的選擇性阻斷劑，顯著抑制高K+誘導(dǎo)的氣管平滑肌的收縮。在實(shí)驗(yàn)完成前后校準(zhǔn)并測(cè)量了灌洗槽內(nèi)的pH，pH 與對(duì)照相比無(wú)明顯差異，排除了pH 值對(duì)鈣離子通道的影響。而大黃酸引起的舒張是由于抑制LVDCC 所致。在平滑肌中，L-型Ca2+通道被認(rèn)為是主要的Ca2+流入途徑［10］，LVDCC 的開(kāi)放引起細(xì)胞外Ca2+大量流入，由此其引發(fā)的鈣離子內(nèi)流使得平滑肌收縮，大黃酸抑制LVDCC，阻止鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致了舒張，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了本文的假設(shè)。

大黃酸作為天然蒽醌類化合物在豆科、蓼科、蕓香科、百合科中廣泛存在，大黃、番瀉葉、決明子、何首烏、蘆薈等中藥材中均含有，其在抗腫瘤、抗炎方面作用突出［11］。已有研究報(bào)道其對(duì)子宮平滑肌具有抑制作用，此作用可能是由細(xì)胞內(nèi)的前列腺素的合成與釋放，或細(xì)胞膜上LVDCC 所介導(dǎo)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)大黃酸對(duì)小鼠氣管平滑肌收縮具有抑制作用，原因是其抑制了細(xì)胞膜上LVDCC。這一結(jié)果為開(kāi)發(fā)大黃酸作為一種新的氣管擴(kuò)張劑提供了依據(jù)。已知大黃酸可減少α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)［8］，是否這是抑制平滑肌收縮的另一原因，還需要進(jìn)一步的檢驗(yàn)。將不同濃度大黃酸與氣管環(huán)共同孵育培養(yǎng)24 h 后，對(duì)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白進(jìn)行mRNA 和蛋白水平的檢測(cè)，這是接下來(lái)需要進(jìn)行的研究。

致謝：本實(shí)驗(yàn)是在中南民族大學(xué)醫(yī)學(xué)生物研究所完成，對(duì)在此實(shí)驗(yàn)中參與及幫助的同學(xué)及老師表示由衷的感謝。