許世林，李佳川*，何曉磊，馬二秀，梁夏瑜，2

（1.西南民族大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610041；2.武漢理工大學(xué) 化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

石榴（Punica granatum）是石榴科植物石榴的果實(shí)，既是優(yōu)質(zhì)的無公害綠色食品，又是中醫(yī)藥、藏醫(yī)藥中常用的臨床藥物[1-2]，具有良好的“藥食同源”之性。川產(chǎn)攀西地區(qū)會(huì)理石榴栽培歷史悠久，名優(yōu)質(zhì)佳，藥食資源道地?，F(xiàn)代研究表明，石榴中不僅富含多酚類、黃酮類及有機(jī)酸類化合物，還富含多種生物堿成分及類雌激素樣成分等[3]，保健開發(fā)潛力巨大[4]。目前，市面上關(guān)于石榴的加工產(chǎn)品主要有石榴果汁[5-7]、石榴酒[8-9]、石榴茶[10-11]和石榴籽油[12-14]等，而有關(guān)石榴果醋鮮有深入研究的報(bào)道。早在20世紀(jì)90年代，果醋就暢銷于歐美等發(fā)達(dá)國家。近年來，隨著深層發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步和世界大趨勢(shì)對(duì)綠色健康功能性食品的認(rèn)同，保健果醋的開發(fā)已成為全球醋研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)階段我國更多的石榴果醋仍處于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)研究階段，研究方向集中于生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，對(duì)成品運(yùn)用于生物藥理活性研究的較少。因此，該研究為進(jìn)一步促進(jìn)特色保健食藥資源的開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，以川產(chǎn)藥食資源石榴為主要原料制備保健石榴果醋，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)石榴保健果醋的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，并采用四氧嘧啶復(fù)合高脂高糖乳液建立小鼠糖脂代謝紊亂模型探討其降糖降脂作用，以期為石榴保健產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料與菌種

青皮軟籽石榴：采摘于四川省涼山彝族自治州會(huì)理縣。安琪葡萄酒、果酒專用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）SICC1.4：四川省微生物資源平臺(tái)菌種保藏中心。

美國癌癥研究所（institute ofcancer research，ICR）小鼠[無特定病原體（specific pathogenfree，SPF）級(jí)，18～22g，全雄，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030]：四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

1.1.2 化學(xué)試劑

鹽酸二甲雙胍片（規(guī)格0.25 g/片）：北京中惠藥業(yè)有限公司；四氧嘧啶（分析純）：美國Amresco公司；血糖測(cè)定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒和甘油三酯（triglyceride，TG）測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；小鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析測(cè)定試劑盒：美國RD公司；氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、碳酸鈣、碳酸氫鈉、葡萄糖（均為分析純）：成都科龍化工試劑有限公司；果膠酶（40 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

醋酸菌液體培養(yǎng)基：酵母膏0.5%，葡萄糖1%，碳酸鈣2%，乙醇2%（滅菌后加入）。在121℃、0.1 MPa條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；PHS-3C-3E數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì)：上海雷磁儀器有限公司；酒精濃度計(jì)：河北武強(qiáng)儀表廠。

1.3 方法

1.3.1 石榴保健果醋加工工藝流程及操作要點(diǎn)

果實(shí)的揀選、清洗：挑選果皮鮮紅柔軟度適中，體積大果皮薄，無腐爛霉變、病蟲的新鮮石榴果實(shí)，用清水輕緩清洗3～4次。

去皮、榨汁、過濾：將清洗干凈的石榴果實(shí)去皮后的果粒進(jìn)行榨汁，出汁率達(dá)48%左右加30 mg/L亞硫酸氫鈉進(jìn)行護(hù)色，待榨汁完全，用120目的濾布過濾果汁中殘留的石榴籽、皮等物質(zhì)。

酶解、成分調(diào)整：在石榴果汁中加入果膠酶0.09 g/L，40℃的條件下酶解2 h，所得果汁較澄清透明[15]。加入10%碳酸氫鈉或10%檸檬酸調(diào)節(jié)果汁pH為4.0。調(diào)整糖度至20%，70℃恒溫滅菌30 min。

活化酵母菌[16]：將5 g安琪酵母置于50 mL的5%的蔗糖溶液中，搖勻，置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中活化30 min，直到蔗糖溶液中出現(xiàn)大量微小氣泡為止。

酒精發(fā)酵：將活化完成的酵母接種至酶解后的石榴果汁中，搖勻后分罐裝瓶，放入29℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵5 d，直至瓶中完全不再產(chǎn)生氣泡為止。

醋酸發(fā)酵：取制備好的石榴果酒（酒精度10.6%vol），每瓶裝液量50 mL/250 mL，調(diào)節(jié)酒精度3%vol～11%vol，添加活化醋酸菌，而后使用紗布封口并放入搖床振蕩器中，調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)溫度進(jìn)行有氧醋酸發(fā)酵[17]，直至不再產(chǎn)酸為止，獲得石榴果醋液。

澄清、陳釀：用2%殼聚糖溶液澄清石榴果醋液。將澄清后的石榴果醋液密封放在避光陰涼的地方陳釀1個(gè)月。

過濾、殺菌：用200目濾布過濾。在75℃條件下殺菌5min。

1.3.2 石榴保健果醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別選取初始酒精度（3%vol、5%vol、7%vol、9%vol、11%vol），接入（4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%）的醋酸菌種，于發(fā)酵溫度（23℃、25℃、27℃、29℃、31℃、33℃）、轉(zhuǎn)速150 r/min的條件下進(jìn)行醋酸發(fā)酵（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d），探討不同初始酒精度、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間條件下總酸含量變化。

1.3.3 石榴保健果醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)[18-20]

以發(fā)酵液總酸含量（Y）為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of response surface tests

1.3.4 分析檢測(cè)

酒精度的測(cè)定采用酒精度比重法；總酸（以醋酸計(jì)）的測(cè)定采用電位滴定法。

1.3.5 石榴保健果醋的降糖降脂活性研究

取ICR小鼠，參照文獻(xiàn)方法建立小鼠高糖、高脂復(fù)合模型[21]，即小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶溶液60 mg/kg造成血糖升高后（即空腹血糖≥11.0 mmol/L），同時(shí)每日灌胃給予高脂高糖乳液（豬油20%、膽固醇10%、豬膽酸鈉0.5%、蔗糖20%）0.2 mL/只，連續(xù)14 d。試驗(yàn)期間按設(shè)計(jì)劑量和分組同步灌胃給藥，每日1次。各組小鼠末次給藥后1 h（禁食不禁水8h），眼眶取血并分離血清，按試劑盒說明書分別測(cè)定小鼠空腹血糖（fastingblood-glucose，F(xiàn)BG）、胰島素（insulin，Ins）、膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量，并按如下公式計(jì)算胰島素敏感指數(shù)（insulin sensitivity index，ISI）。

ISI=1（/FBG×Ins）

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始酒精度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖1 初始酒精度對(duì)總酸含量的影響Fig.1 Effect of initial alcohol content on total acid contents

由圖1可知，隨著酒精度在3%vol～9%vol范圍內(nèi)的增加，醋酸菌的營養(yǎng)物質(zhì)增多，醋酸菌繁殖迅速，發(fā)酵液總酸含量也呈上升趨勢(shì)；當(dāng)初始酒精度達(dá)9%vol時(shí)，發(fā)酵液的總酸含量可達(dá)到最大值，為4.62 g/100 mL；而當(dāng)初始酒精度＞9%vol之后，酒精濃度對(duì)醋酸菌的生長繁殖產(chǎn)生抑制作用，發(fā)酵液總酸含量呈下降趨勢(shì)。因此，確定最適初始酒精度為9%vol。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)總酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid contents

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度在23～29℃范圍內(nèi)的增高，果醋發(fā)酵液中的總酸含量呈上升的趨勢(shì)；發(fā)酵溫度為29℃時(shí)，發(fā)酵液總酸含量可達(dá)最大值，為4.71 g/100 mL；當(dāng)發(fā)酵溫度高于29℃之后，發(fā)酵的溫度過高，醋酸菌就會(huì)提前老化，導(dǎo)致發(fā)酵停止，發(fā)酵液的總酸含量逐漸呈下降趨勢(shì)。因此，確定29℃為最適發(fā)酵溫度。

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在2～8 d范圍內(nèi)增加，發(fā)酵液的總酸含量不斷增加；在發(fā)酵時(shí)間為8 d時(shí)，總酸含量可達(dá)最大值，為4.67 g/100 mL；發(fā)酵時(shí)間＞8 d之后，醋酸菌在乙醇底物基本耗盡的情況下，發(fā)生了過氧化反應(yīng)，繼續(xù)氧化醋酸生成二氧化碳和水，導(dǎo)致溶液中的總酸含量不斷下降，溶液總酸含量開始逐漸下降。因此，確定8 d為最適發(fā)酵時(shí)間。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on total acid contents

2.1.4 接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

由圖4可知，隨著醋酸菌的接種量在4%～10%范圍內(nèi)增加，發(fā)酵體系的總酸含量也隨之增高；當(dāng)醋酸菌的接種量達(dá)10%時(shí)，發(fā)酵液總酸含量可達(dá)最高，為4.70g/100mL；而當(dāng)接種量＞10%之后，由于過高的接菌量使得單位面積內(nèi)的醋酸菌過多，會(huì)發(fā)生菌體自溶、早衰、代謝廢物過多等現(xiàn)象；并且由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗量的增加，可導(dǎo)致后期營養(yǎng)物質(zhì)的不足，導(dǎo)致溶液的總酸含量有明顯的下降。因此，確定10%為最佳接種量。

圖4 接種量對(duì)總酸含量的影響Fig.4 Effect of inoculum on total acid contents

2.2 醋酸發(fā)酵工藝響應(yīng)面法優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以初始酒精度（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）及接種量（D）為影響因素，以發(fā)酵液總酸含量（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析，結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

通過Design-Expert 10.08軟件對(duì)表2進(jìn)行回歸擬合分析[22]，得到總酸含量對(duì)多個(gè)影響因素之間的回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析Table2 Results and analysis of response surface tests design

由表3可知，回歸模型P＜0.000 1，回歸模型方程極顯著，失擬項(xiàng)P=0.108 8＞0.05，不顯著，表明該方程合理可行，且決定系數(shù)R2=0.953 4，校正決定系數(shù)0.906 8，表明這個(gè)回歸模型可以解釋90.68%的響應(yīng)值的變化，回歸方程對(duì)試驗(yàn)的擬合性比較好，所以用此模型和方程來尋求醋酸發(fā)酵的最適條件是可行的。一次項(xiàng)B、C、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的P值均＜0.01，均對(duì)結(jié)果影響極顯著。

表3 回歸模型的方差分析Table3 Variance analysis of regression model

接種量、初始酒精度和發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度各因素兩兩交互對(duì)石榴果醋發(fā)酵的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，響應(yīng)曲線陡峭，等高線呈橢圓，說明二者交互作用對(duì)發(fā)酵液總酸含量的影響越顯著。

圖5 初始酒精度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間及接種量交互作用對(duì)總酸含量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface plots and contour line of the effects of interaction between initial alcohol content,fermentation temperature,time and inoculum on total acid contents

通過軟件Design-Expert 10.08軟件分析得到石榴保健醋醋酸發(fā)酵工藝的最佳條件為初始酒精度9.025%vol、發(fā)酵溫度29.030℃、發(fā)酵時(shí)間8.173 d，接種量10.113%，總酸含量預(yù)測(cè)可達(dá)最大值4.807 g/100 mL。結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際操作的可行性，將上述最優(yōu)化條件簡化為初始酒精度9%vol、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間8 d，接種量10%。以響應(yīng)面分析得到的最佳結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)得石榴果醋發(fā)酵液總酸含量平均值為4.732 g/100 mL，與預(yù)測(cè)值接近，表明通過響應(yīng)面分析法得到的優(yōu)化條件結(jié)果可靠。

2.3 石榴保健果醋的降糖降脂活性

表4 石榴果醋對(duì)小鼠糖脂代謝水平及胰島素抵抗指數(shù)的影響Table4 Effect of pomegranate fruit vinegar on the glucose and lipid metabolism levels and insulin resistance index of mice

由表4可知，與空白組比較，經(jīng)小劑量注射四氧嘧啶和高脂高糖乳液喂養(yǎng)小鼠4周后，模型組小鼠血清空腹血糖（FBG）、膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量明顯升高，胰島素（Ins）的含量明顯降低，小鼠胰島素敏感指數(shù)（ISI）顯著下降，表明小鼠糖脂代謝紊亂模型造模成功。與模型組相比較，石榴保健果醋能明顯或部分降低小鼠血清空腹血糖（FBG）、TC和TG的含量，提高機(jī)體的ISI，但對(duì)血清Ins水平?jīng)]有明顯影響，顯示出較好的改善胰島素抵抗，改善糖脂代謝作用。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析的方法建立了回歸模型，以總酸含量為響應(yīng)值，初始酒精度、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量為影響因素，得到的醋酸發(fā)酵的最佳工藝條件為初始酒精度9%vol、發(fā)酵溫度29℃、發(fā)酵時(shí)間8 d，接種量10%。在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，石榴果醋總酸含量可達(dá)4.732 g/100 mL，發(fā)酵所得石榴果醋顏色鮮紅，果醋香氣濃郁，風(fēng)味俱佳。同時(shí)，通過對(duì)小鼠高糖、高脂復(fù)合模型的建立，藥效試驗(yàn)顯示石榴保健果醋能明顯或部分降低小鼠血清FBG、TC和TG的含量，升高ISI，提高機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，顯示出較好的改善糖脂代謝作用。通過本研究不僅提高了石榴的使用價(jià)值，也為石榴相關(guān)保健產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。