李 麗,夏 蓉*,卞晶晶
(1.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術學院 鎮(zhèn)江分院鎮(zhèn)江高等職業(yè)技術學校 機電工程系,江蘇 鎮(zhèn)江 212000;2.鎮(zhèn)江恒順生物工程有限公司,江蘇 鎮(zhèn)江 212021)
鎮(zhèn)江醋素有“天下美酒推茅臺,世上食醋數鎮(zhèn)江”之說,其原料主要包括大米(糯米、粳米、秈米)、辣蓼草、麩皮、大麥、小麥、豌豆、黃酒糟、食鹽、食糖等。鎮(zhèn)江醋因其“酸而不澀,香而微甜,色濃味鮮,愈存愈香”的特色,受到國內外消費者的青睞。2006年6月,經歷了170多年有序傳承的“鎮(zhèn)江恒順醋釀制技藝”被列入第一批國家非物質文化遺產名錄。2012年7月,中國鎮(zhèn)江醋成為首個在歐盟注冊的食醋類地理標志保護(protected geographic indication,PGI)產品。歐盟、美國、日本等國也成為鎮(zhèn)江食醋的主要出口目的地[1]。
對于植物源性的產品(如糯米、小麥等),歐盟[2]、美國[3]、日本都有明確的農藥殘留限量的規(guī)定。近年來,這些國家實施了越來越嚴格的殘留限量的要求,其中歐盟對于未制定最高殘留限量的農藥實施了“一律標準”,均不得檢出(檢出限10 μg/kg)[4],這對中國農產品的出口帶來考驗,對以糧食為主要原料釀制的食醋同樣有著嚴重的影響[5]。因此,在嚴格控制生產原料質量、確保相關農藥殘留合格的同時,對最終產品中農藥殘留的檢測也尤為重要。目前,植物源性產品中農藥殘留的檢測方法包括液相色譜質譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)法[6-9]、氣相色譜質譜(gaschromatography-mass spectrometry,GC-MS)法[10]、氣相色譜(gas chromatography,GC)法[11-12]等。提取待測組分經常采用的試劑包括乙腈、乙酸乙酯、甲苯、丙酮、二氯甲烷等。但這些提取、測定方法主要針對蔬菜、水果、谷物以及一些動物源性類的產品,沒有專門針對醋中農藥殘留提取的描述,缺乏針對性的檢測方法。
因此,本研究選擇了有機氮、甲氧基丙烯酸酯、擬除蟲菊酯、三唑類、喹唑啉類、雜環(huán)類、有機磷、二甲酰亞胺類、醚類、吡咯類、氨基甲酸酯類、酰胺類、苯基吡唑類、嘧啶胺類、苯胺類、芳香族化合物、取代硝基苯、聯(lián)苯肼等共計19類農藥進行樣品前處理的研究,在此基礎上建立了食醋中多組分農藥殘留的氣相色譜-串聯(lián)質譜(gas chromatographytandem mass spectrometry,GC-MS/MS)的檢測方法,并對市售食醋產品進行篩查,積累農藥殘留的本底數據,確保食醋的質量安全。
50份鎮(zhèn)江食醋:當地超市。
乙腈、環(huán)己烷、甲苯、丙酮、二氯甲烷(均為色譜純):德國Merck公司;氨水、氯化鈉(均為分析純):上海國藥集團;N-丙基乙二胺(primarysecondaryamine,PSA)固體粉末:上海安普公司;石墨化炭黑(graphitized carbon blacks,GCB):深圳逗點公司;農藥標準品(純度均>98.5%):德國Dr.Ehrenstorfe公司。
Agilent 7890A氣相色譜儀、Agilent 7000B GC-MS/MS儀、Agilent 7693自動進樣器:美國安捷倫公司;ME-T電子天平、SevenExcellence pH計:瑞士梅特勒公司;3K15高速冷凍離心機:德國Sigma公司;XW-80A渦旋混合器:上海醫(yī)科大學儀器廠。
1.3.1 樣品前處理
本研究采用乙腈、甲苯、丙酮、二氯甲烷、環(huán)己烷溶劑對醋中的農藥進行提取,考察不同萃取劑對待測組分的提取效率和樣品基質的干擾。以樣品基質干擾小、回收率符合相關的技術要求為依據,優(yōu)化組合后[13-14],確定樣品的提取和凈化程序:量取100 mL食醋于200 mL燒杯中,在pH計上逐滴加入氨水中和至pH 7.0。吸取3.0 mL中和后的食醋液于50 mL離心管中,加入2.0 g氯化鈉,渦旋30 s。加入最優(yōu)萃取溶劑,渦旋混勻3min。8000r/min離心5min后,有機相和水相結合處會有絮狀物質,分層不清。用手輕輕搖晃離心管,讓有機相和水相結合處的絮狀物質徹底分散,再以13000r/min離心10min,取上清液10 mL凈化。
凈化:先用5 mL甲苯溶液清洗GCB小柱并保持柱床的濕潤,取上清液10 mL過柱,過柱結束后用2 mL甲苯清洗GCB小柱,合并濾液,氮吹至干。殘渣中加入1 mL乙腈和100 mg PSA,渦旋混勻2 min,過有機相膜,供GC-MS/MS測定。
1.3.2 檢測條件
氣相色譜條件:DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為氦氣(He);流速為1.0 mL/min;進樣量為1.1 μL,不分流進樣;進樣口溫度為250℃;程序升溫條件:初始溫度70℃,保持3 min;以10℃/min升至105℃,保持2 min;以10℃/min升至180℃,保持2 min;以6℃/min升至250℃,保持4 min;以5℃/min升至280℃,保持2 min;以20℃/min升至300℃,保持5 min。溶劑延遲10 min。
質譜條件:離子化模式為電子電離(electronionization,EI)源;電離能量為70 eV;離子源溫度為230℃;GC-MS/MS接口溫度為270℃;多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式。
定性定量:以待測組分的保留時間和離子對作為定性依據;以相對豐度較高的離子作為定量離子。
1.3.3 標準曲線的建立
吸取100.0μL52種農藥的混合標準溶液(1250.0μg/L)于900.0μL乙腈溶液中,渦旋混勻。再用乙腈進行倍比稀釋,使混合標準溶液的質量濃度分別為7.81 μg/L、15.60 μg/L、31.20 μg/L、62.50 μg/L、125.00 μg/L。以峰面積(Y)對質量濃度(X)繪制標準工作曲線。
1.3.4 方法回收率及精密度
用經過篩查的不含待測組分的空白樣品進行加標回收試驗,添加水平為10.0 μg/L、20.0 μg/L和40.0 μg/L,每個加標水平測定6次,得出方法的回收率及精密度。
1.3.5 方法檢出限及定量限
參照文獻[15]的方法,量取100 mL食醋于200 mL燒杯中,加入農藥混合標準溶液290μL(1000.0μg/L),按照1.3.1進行樣品的前處理。重復測定7次,以3∶1的信噪比確定方法的檢出限(limit of detection,LOD),以10倍的信噪比確定方法的定量限(limit of quantitation,LOQ)。
1.3.6 食醋樣品的檢測
按照方法1.3.1對食醋中的殘留農藥進行提取和凈化,采用氣相色譜-串聯(lián)質譜法進行檢測。
食醋中含有約5%的乙酸,乙酸能與乙腈互溶,在甲苯中也有一定的溶解度。因此,采用宋碧君等[16-17]的方法(鹽析法)直接用乙腈、甲苯提取食醋中的農藥殘留,乙酸會將樣品中的非目標化合物帶入提取液中,基質干擾大。采用丙酮、二氯甲烷提取出的色素含量較多,不利于后續(xù)的樣品提取液的凈化。用環(huán)己烷提取,有機磷類的農藥回收率偏低。以乙腈提取為例,空白樣品中鄰苯基苯酚、氧化樂果、克百威、硫環(huán)磷、苯醚甲環(huán)唑都呈假陽性,雙甲脒的回收率<10%。
乙酸銨在乙腈、甲苯、環(huán)己烷等有機溶劑中溶解度都非常小甚至不溶解,因此將醋中的乙酸用氨水中和成乙酸胺,再用有機試劑提取,可以有效減少樣品基質的干擾。因此,分別考察了乙腈、甲苯、環(huán)己烷的提取效果。單獨用乙腈提取,硫環(huán)磷和雙甲脒的回收率<10%,并且提取液中色素含量較高;純甲苯提取,包括甲苯氟磺胺、喹螨醚、嘧菌酯等19種物質的回收率偏高;純環(huán)己烷對于有機磷類農藥的提取效果不好,回收率偏低。
參考文獻[18]依據不同農藥在甲苯和環(huán)己烷中的溶解度不同,采用甲苯和環(huán)己烷的混合溶液進行提取。甲苯/環(huán)己烷提取液中含有少量的色素,用GCB[19-20]凈化可以有效去除這部分色素,減少樣品提取液對色譜柱和質譜的污染,降低基質的干擾;PSA的使用可以有效降低樣品基質對菊酯類物質的增益影響。因此,對甲苯、環(huán)己烷、PSA的用量進行了3因素3水平的正交試驗[13-14],以樣品基質干擾小、回收率符合相關的技術要求為判定依據,確定了甲苯/環(huán)己烷的提取方式以及樣品提取液的凈化方法,確定甲苯添加量為10 mL,環(huán)己烷添加量為5 mL,PSA添加量為50 mg。
食醋中各待測組分的保留時間(retention time,RT)、特征離子、碰撞能量等參數見表1,52種農藥混標(62.5 μg/L)的總離子流色譜圖見圖1。
表1 52種農藥的保留時間、特征離子、碰撞能量等參數Table1 Retention time,characteristic ions and collision energy of 52 kinds of pesticides
續(xù)表
圖1 多組分農藥殘留的GC-MS/MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of multi-component pesticides residue analysis by GC-MS/MS
由表1可知,各種農藥均能產生豐富的碎片離子,用于定量、定性分析。由圖1可知,52種農藥組分在15.93~37.46min內分離效果良好,避免了各種農藥之間相同碎片離子的相互干擾。
52種農藥的標準曲線、線性范圍見表2。
表2 52種農藥的標準曲線、線性范圍Table2 Standard curves and linearity ranges of 52 kinds of pesticides
續(xù)表
由表2可知,52種農藥在質量濃度為7.81~125 μg/L的范圍內,相關系數R2均>0.99,線性關系良好,可用于52種農藥的檢測。
食醋中52種農藥的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)結果見表3。
由表3可知,食醋中52種農藥的相對標準偏差(RSD)在5.90%~11.4%范圍內,表明該方法精密度良好[21]。
表3 方法精密度試驗結果Table3 Results of precision tests for the method
食醋中52種農藥的加標回收率試驗結果見表4。
表4 加標回收率試驗結果Table4 Results of adding standard recovery tests
續(xù)表
由表4可知,52種農藥的回收率在78.5%~112%范圍內,表明該方法的準確性良好[21]。
52種農藥的檢出限均為5 μg/L,定量限均為10 μg/L。
50份食醋樣品中均未檢出農藥殘留。
在優(yōu)化樣品前處理條件以及儀器參數的基礎上建立了GC-MS/MS法檢測食醋中的多組分農藥殘留的測定方法。食醋經氨水中和后,采用甲苯/環(huán)己烷的混合溶液提取食醋中的待測組分,能有效降低醋的基質干擾。目標化合物在一定質量濃度范圍內(7.81~125 μg/L)線性關系良好,相關系數R2均>0.99。方法的定量限和檢出限分別為10.0 μg/L、5.00 μg/L,平均回收率為78.5%~112.0%,相對標準偏差(RSD)為5.90%~11.40%。該方法簡便、快速,準確,已成功應用于市售食醋中農藥殘留的檢測。為確保食醋的安全質量提供技術支撐。