何吉子，陳秀明*，梁瑞婷，李 雙，張仕云，麥麗珊

（1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.南沙海關(guān)，廣東 廣州 510623；3.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623；4.北京師范大學(xué) 香港浸會大學(xué)聯(lián)合國際學(xué)院 珠海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海 519000）

乳糖是嬰幼兒生長發(fā)育必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，乳糖不但是小兒體內(nèi)器官、神經(jīng)、四肢、肌肉等發(fā)育及活動的動力，而且促進(jìn)小兒腸道內(nèi)的乳酸菌繁殖增長，在腸道中乳糖在乳酸桿菌、乳酸鏈球菌、多種酶及其他某些微生物的作用下生成乳酸，乳酸對小兒腸胃有調(diào)整保護(hù)作用[1-4]。乳糖還參與鈣的代謝過程，促進(jìn)骨骼發(fā)育，避免因缺鈣而造成佝僂病[5-6]。此外，乳糖在消化系統(tǒng)內(nèi)水解成半乳糖，能夠?qū)δX甙和粘多糖的合成起到促進(jìn)作用，對嬰幼兒的智力發(fā)育產(chǎn)生巨大影響[7]。

目前奶粉中的乳糖和蔗糖的常用檢測方法是國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》中的高效液相色譜法，但該方法的缺點(diǎn)是樣品前處理耗時長、步驟繁瑣等，因此，尋找一種提高檢測效率的方法勢在必行。

隨著科技的發(fā)展，近紅外光譜檢測技術(shù)取得了較快的發(fā)展，該技術(shù)具備快速、制樣簡單、同時測定多組分、不使用有機(jī)試劑、無污染、非破壞性分析等優(yōu)點(diǎn)[8]。國內(nèi)外一些學(xué)者利用近紅外光譜技術(shù)對奶粉的營養(yǎng)成分進(jìn)行了快速檢測，特定物質(zhì)的掃描圖譜是特定的，光譜分析能夠確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，具有代表性，能夠應(yīng)用于奶粉的質(zhì)量監(jiān)控證明了該方法的可行性[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)利用傅立葉變換近紅外光譜（Fourier transform near-infraredspectroscopy，F(xiàn)T-NIR）儀快速檢測嬰幼兒配方奶粉中的乳糖。通過高效液相色譜（highperformance liquid chromatography，HPLC）法所測的乳糖值作為樣品的校驗(yàn)值，用偏最小二乘法（partial least-square，PLS）選擇最優(yōu)光譜模型，預(yù)測未知樣品的乳糖值。該方法不僅提供了較低的檢出限，較寬的動態(tài)線性范圍，檢測和數(shù)據(jù)處理全部自動化，大大提高了工作效率，為乳糖成分的檢測提供一種樣品無損、操作簡單、快速的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方奶粉樣品94個（其中第1階段奶粉38個，第2階段奶粉26個，第3階段奶粉30個，包括美贊臣、雅培、金禧羊羊、合生元等12個品牌）市售；乳糖（純度99.9%）：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；乙腈（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；硫酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純）上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Millipore-QA10純水：美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Millipore-QA10超純水系統(tǒng)：廣州立諾自動化設(shè)備有限公司；FT-NIRSpectrum400傅立葉變換近紅外光譜儀：美國Perkin Elmer公司；LC-20高效液相色譜儀：日本島津公司；ELSD3300奧泰蒸發(fā)光散射檢測器：瑞士步琦有限公司；液相色譜柱氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：月旭科技（上海）股份有限公司；XPE205分析天平（感量為0.000 1 g）：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖含量的測定[12]

前處理：稱取樣品1.0 g于50 mL容量瓶中，加15 mL 50～60℃純水溶解，于超聲波振蕩器中振蕩10 min，用乙腈定容至刻度，靜置數(shù)分鐘，過濾。取5.0mL過濾液于10mL容量瓶中，用乙腈定容，通過0.45 μm濾膜過濾，濾液供高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：色譜柱為氨基柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水=（70∶30，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量10 μL，示差折光檢測工作溫度33～37℃，蒸發(fā)光散射檢測工作條件為維持飄移管溫度在85～90℃，維持氣流量為2.5 L/min，撞擊器為關(guān)閉狀態(tài)。

乳糖（20 mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制：稱取在94℃烘箱中干燥2 h的乳糖標(biāo)樣2.0 g（精確至0.1 mg），溶于純水中，用純水稀釋至100 mL容量瓶中，冷卻到室溫備用。

乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取10 mL容量瓶6個，分別加入乳糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液0、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00mL，用乙腈定容至刻度。此系列乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為0、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL。將配制好的系列乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析。以峰面積（Y）對乳糖溶液的質(zhì)量濃度（X）繪制乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=70 932x-2 609，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3。

1.3.2 嬰幼兒配方奶粉的近紅外光譜采集

環(huán)境溫度20℃，相對濕度45%，光譜掃描范圍10 000～4 000 cm-1，分辨率為16 cm-1，掃描次數(shù)為32次，用Spectrum Touch軟件對奶粉樣品進(jìn)行光譜采集及分析，重新裝樣并采集2次。對平均光譜進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采樣間隔為8 cm-1，分辨為4 cm-1。

用高效液相色譜法測定嬰幼兒配方奶粉中乳糖作為樣品的指定值，從小到大排序。在94個樣品中，抽取6個樣品（包括3個第1階段，2個第2階段，1個第3階段）作為驗(yàn)證集樣品數(shù)，不參與建模計(jì)算，剩余88個樣品為校正集樣品數(shù)，參與建立乳糖含量校正模型。為剔除無效信息，在建立模型的過程中對樣品的原始近紅外光譜圖進(jìn)行預(yù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 近紅外光譜采集圖

嬰幼兒奶粉的原始近紅外圖譜如圖1所示，在波數(shù)為10 000～4 000 cm-1光譜掃描范圍內(nèi)樣品具有較強(qiáng)的噪音，在波數(shù)為8 923.1～4 000.0 cm-1之間具有明顯的特征吸收峰，沿Y軸均有基線漂移現(xiàn)象。測試過程中受到樣品散射的影響，各光譜間的平行移動也相對明顯。

圖1 嬰幼兒奶粉樣品原始近紅外圖譜Fig.1 Original near infrared spectra of infant formula milk powder samples

對近紅外圖譜進(jìn)行一階導(dǎo)數(shù)（first derivative，D1）處理后，如圖2所示，光譜圖的吸收峰差異更加明顯，沿Y軸基線漂移校正明顯，但發(fā)現(xiàn)有個別樣品偏離整體的現(xiàn)象，且較為雜亂。

對近紅外圖譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)（first derivative，D2）處理之后，如圖3所示，雖然也有個別樣品偏離整體，但是相對一階導(dǎo)數(shù)（D1）處理而言，其光譜圖的吸收峰較為整齊，同時加強(qiáng)了樣品之間的光譜圖吸收峰差異，定標(biāo)效果明顯。

圖2 嬰幼兒奶粉樣品近紅外圖譜一階導(dǎo)數(shù)（D1）圖Fig.2 First derivative(D1)diagram of near infrared spectra of infant formula milk powder samples

2.2 不同光譜預(yù)處理方法對乳糖含量建模的影響

光譜預(yù)處理和定量模型建立采用Spectrum Touch分析軟件，多元散射校正（multiplcative scatter correct，MSC）方法是目前多波長定標(biāo)建模常用的一種數(shù)據(jù)處理方法。多元散射校正（MSC）可以去除近紅外漫反射光譜中樣品的鏡面反射及不均勻性造成的噪聲，消除漫反射光譜的基線及光譜的不重復(fù)性[13-15]。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（standard normalizedvariate，SNV）是對每條光譜單獨(dú)進(jìn)行校正，一般認(rèn)為它的校正能力比MSC要強(qiáng)，尤其是樣品組分變化較大的時候。導(dǎo)數(shù)既可以消除基線漂移或平緩背景干擾的影響，也可以提供比原光譜更高的分辨率和更清晰的輪廓變化，從而更為細(xì)致地反映樣品的光譜特征。偏最小二乘法在近紅外光譜分析中得到最為廣泛的應(yīng)用，是多元線性回歸、典型相關(guān)分析和主成分分析的完美結(jié)合[16-18]。

本實(shí)驗(yàn)定量預(yù)測建模數(shù)據(jù)分別用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（SNV）、多元散射校正（MSC）、一階導(dǎo)數(shù)（D1）、二階導(dǎo)數(shù)（D2）、大氣加權(quán)、平滑數(shù)等方法相互結(jié)合，通過上述方法得到最優(yōu)光譜區(qū)間，利用偏最小二乘法（PLS）建立嬰幼兒奶粉中乳糖含量的校正數(shù)學(xué)模型，以方差D（X）、標(biāo)樣估計(jì)誤差（standard sample estimation error，SEE）、預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（standard error of prediction，SEP）及交叉驗(yàn)證預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（cross validation of predicted standard deviation，CVSEP）作評價模型的精密度。方差D（X）越大時，標(biāo)樣估計(jì)誤差（SEE），預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（SEP）及交叉驗(yàn)證預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（CVSEP）就會越小，表示模型的定標(biāo)效果越好，預(yù)測的精密度越高，模型越穩(wěn)健[19-20]。通過Spectrum Touch分析軟件，選擇不同的預(yù)處理方法，所得結(jié)果有所差異。本實(shí)驗(yàn)挑選了5個結(jié)果理想的預(yù)處理方法進(jìn)行對比，結(jié)果見表1。

表1 近紅外光譜法的5個預(yù)處理方法Table1 Five pretreatment methods of near infrared spectra

由表1可知，第5種方法的組合預(yù)處理方法的方差D（X）、SEE、SEP、CVSEP分別是95.4235%、1.157、1.18和2.345，在所有預(yù)處理方法中方差D（X）為最大，標(biāo)樣估計(jì)誤差（SEE）、預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（SEP）及交叉驗(yàn)證預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)差（CVSEP）為最小，模型最穩(wěn)健，預(yù)測可靠性最好。因此，選用第5種方法（二階導(dǎo)數(shù)（D2）+標(biāo)準(zhǔn)矢量歸一化（SNV）+平滑（半寬點(diǎn)數(shù)9）+傳輸加權(quán)的光譜預(yù)處理方法）的模型作為預(yù)測乳糖值的模型。

2.3 模型的檢驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)利用校正集樣品檢驗(yàn)乳糖的預(yù)測值（即估計(jì)值）與指定值的相關(guān)性，結(jié)果見圖4。由圖4可知，乳糖校正模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.963 4，表明預(yù)測值與指定值的相關(guān)性良好。

由該模型對6個未知樣品（包括3個第1階段，2個第2階段，1個第3階段）進(jìn)行測定的結(jié)果比較，結(jié)果見表2。由表2可知，未知樣品由該模型測定的乳糖值與液相色譜分析方法測定的乳糖值的關(guān)系符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》中的要求，因此說明該模型具有可行性。

圖4 校正集樣品中乳糖估計(jì)值與指定值的相關(guān)性Flg.4 Correlation between predicted values and real values of lactose content in calibration set

表2 高效液相色譜法的乳糖值與模型預(yù)測的乳糖值比較Table2 Comparison of lactose value determined by HPLC and model

2.4 模型預(yù)測能力的精密度和穩(wěn)定性

由表3可知，樣品的乳糖含量測定結(jié)果平均相對誤差≤0.67%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）≤0.88%。結(jié)果顯示，所建模型的精密度和穩(wěn)定性良好。

表3 模型預(yù)測能力的精密度和穩(wěn)定性檢驗(yàn)Table3 Precision and stability test of model predictive power

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用偏最小二乘法（PLS）建立嬰幼兒奶粉中乳糖含量的校正模型，選擇二階導(dǎo)數(shù)（D2）+標(biāo)準(zhǔn)矢量歸一化（SNV）+平滑（半寬點(diǎn)數(shù)9）+傳輸加權(quán)的光譜預(yù)處理方法，模型可以達(dá)到較理想的預(yù)測精度，模型的方差D（X）、SEE、SEP、CVSEP分別為95.4235%、1.157、1.18和2.345。模型的外部驗(yàn)證中，模型測定的乳糖值與液相色譜分析方法測定的乳糖值的絕對誤差符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》中的要求。模型的預(yù)測精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)顯示，乳糖的預(yù)測平均相對誤差均≤0.67%，RSD均≤0.88%，模型有較好的精密度和穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)建立的傅立葉變換近紅外光譜快速檢測法，樣品無損、操作簡單、快速，能有效地運(yùn)用于嬰幼兒配方奶粉中乳糖的日常檢測。