曾麗萍，戴立威，吳姍姍，田文妮，黎 攀，杜 冰*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）是蘭科石斛屬多年生草本植物，其主要藥用部位是新鮮或干燥的莖，是傳統(tǒng)名貴中藥材[1-2]。鐵皮石斛含有多糖、芪類、生物堿、氨基酸和礦物質(zhì)元素等多種成分[3]，具有增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗氧化、促消化、促進(jìn)唾液分泌、降血糖、降血壓、抗肝損傷、抗腫瘤等方面藥理作用[4-6]。目前，鐵皮石斛的食用方法主要有鮮食[7]、泡茶[8]、煲湯[9]、浸酒[10]、榨汁[11]等。其中鐵皮石斛酒多為簡單泡制，石斛浸泡酒往往采用酒精度較高的酒浸泡，因此存在口感較刺激等問題，而且難以將活性成分完全溶出，不易被消費(fèi)者接受[12]。而發(fā)酵酒酒精度適宜，口感酸甜可口，而且能更好的溶出有效活性物質(zhì)，適宜人群較為廣泛[13-15]。但是目前在發(fā)酵酒方面，單用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）往往存在發(fā)酵后酒精度高，酸度不足，風(fēng)味欠缺。產(chǎn)乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106是好氧菌，主要產(chǎn)物是乳酸[16]，將產(chǎn)乳酸芽孢桿菌與釀酒酵母菌按照一定比例混合，能夠更好的調(diào)節(jié)發(fā)酵酒的口感。因此，本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化鐵皮石斛發(fā)酵酒工藝，以期為鐵皮石斛的深加工提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：云南芒市紅河群鑫石斛種植有限公司；芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106：篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)新資源食品與功能性原料評價及研究中心鑒定及保藏，菌粉濃度達(dá)1012CFU/g；釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）171：安琪酵母公司，本實(shí)驗(yàn)室保藏，菌粉濃度為108CFU/g。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BS110S精密電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；WYT手持糖量計：早州中友光學(xué)儀器有限公司；VD-650桌上式潔凈式工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鐵皮石斛發(fā)酵酒的工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料預(yù)處理：將鐵皮石斛干條洗凈后切成1 cm左右的小段，100℃熱燙2～3 min，瀝干水，按料液比1∶4的比例加入20 g/L白砂糖溶液，制得發(fā)酵體系。

菌種活化、配比：將0.1g產(chǎn)乳酸芽孢桿菌菌粉加入50mL已滅菌的生理鹽水中，30℃活化30 min，得產(chǎn)乳酸芽孢桿菌活化液；將0.5 g釀酒酵母菌加入50 mL的5 g/L白砂糖溶液中，30℃活化30 min，得釀酒酵母菌活化液。將兩種菌種活化液以一定比例混合，得到菌種活化液。

發(fā)酵：在之前制得的發(fā)酵體系中添加一定量的菌種活化液，一定條件下進(jìn)行發(fā)酵。

過濾：用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.3.2 鐵皮石斛發(fā)酵酒工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定其他條件不變，分別考察菌種配比（芽孢桿菌活化液：釀酒酵母菌活化液（V/V））：1∶1、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20；菌種活化液添加量：1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%；發(fā)酵溫度：26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；發(fā)酵時間：1d、2d、3d、4d、5d、6d、7 d、8 d、9 d、10 d、11 d，對鐵皮石斛發(fā)酵酒的總酸、酒精度和感官評分的影響。

1.3.3 鐵皮石斛發(fā)酵酒工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗(yàn)對鐵皮石斛發(fā)酵酒的品質(zhì)進(jìn)行綜合評價，以確定最佳的發(fā)酵工藝。正交試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 鐵皮石斛發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization of fermentedDendrobium candidumwine

1.3.4 測定方法

酒精度[17]：按GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》測定；總酸[18]：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定；可溶性固形物[19]：采用手持糖度計測試。

感官評價標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選擇10名食品專業(yè)人員，從鐵皮石斛發(fā)酵酒產(chǎn)品的色澤、香氣、口感、組織狀態(tài)4個指標(biāo)進(jìn)行評定，滿分100分，感官評分結(jié)果取平均值，評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 鐵皮石斛發(fā)酵酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table2 Sensory evaluation standards of fermentedDendrobium candidumwine

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛發(fā)酵酒工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 菌種配比對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖1 菌種配比對鐵皮石斛發(fā)酵酒感官評分的影響Fig.1 Effect of strains ratio on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

由圖1可知，隨著芽孢桿菌活化液與釀酒酵母菌活化液配比的變化，鐵皮石斛發(fā)酵酒的感官評分則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)菌種配比（芽孢桿菌活化液∶釀酒酵母菌活化液為1∶10（V/V））時，感官評分最高，為90.4分。

兩種菌的發(fā)酵產(chǎn)物不同，發(fā)揮的作用不同，其產(chǎn)物可能互相影響，且對鐵皮石斛發(fā)酵酒的風(fēng)味的影響也不同[20]。當(dāng)芽孢桿菌的比例過大時，鐵皮石斛發(fā)酵酒中的總酸含量高，風(fēng)味過酸，口感粗糙且略刺激，因此，感官評分較低；而當(dāng)釀酒酵母菌的比例過大時，鐵皮石斛發(fā)酵酒的色澤偏黃較深，酸度不足，酒味偏重，口感不柔和，因此，感官評分也有所降低。芽孢桿菌活化液∶釀酒酵母菌活化液的比例為1∶10（V/V）時，鐵皮石斛發(fā)酵酒的口感良好，酒體呈淺紅色，酒精度適宜，感官評分最高。因此，確定芽孢桿菌和釀酒酵母菌的比例為1∶10（V/V）。

2.1.2 菌種活化液添加量對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著菌種活化液添加量不斷增加，鐵皮石斛發(fā)酵酒的感官評分呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)菌種活化液添加量為1.0%，鐵皮石斛發(fā)酵酒的總酸和酒精度均稍顯不足，口感粗糙，色澤不佳，因此，感官評分較差；菌種活化液添加量為1.5%時，鐵皮石斛發(fā)酵酒酸度不足，整體口感偏苦澀；菌種活化液添加量為2.0%時，甜酸適度，酒味適宜，因此，感官評分較佳，為90.2分。而繼續(xù)增大菌種活化液的添加量，其風(fēng)味差異不顯著。

圖2 菌種活化液添加量對鐵皮石斛酒感官評分的影響Fig.2 Effect of strain activation solution addition on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

在一定程度上，菌種的增加，有利于發(fā)酵產(chǎn)物的增加，但當(dāng)添加量超過一定量的時候，發(fā)酵產(chǎn)物的累積可能趨于穩(wěn)定，甚至減少。這是因?yàn)楫?dāng)添加量過多時，導(dǎo)致微生物繁殖過快，反而造成營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，影響其生長發(fā)酵[21]。而且過快的產(chǎn)生過多的酸性物質(zhì)或酒精，也會抑制菌種自身的生長和繁殖，對發(fā)酵同樣不利。不斷的增加菌種活化液的添加量也會增大在實(shí)際生產(chǎn)中的生產(chǎn)成本。因此，綜合考慮，確定最佳菌種活化液添加量為2.0%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖3 發(fā)酵溫度對鐵皮石斛酒感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，鐵皮石斛酒的感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時，感官評分最高，為91.2分。

當(dāng)發(fā)酵溫度低于30℃時，鐵皮石斛發(fā)酵酒的酸度和酒精度都稍顯不足，口感過甜，因此感官評分偏低；發(fā)酵溫度高于30℃時，口感偏酸且略刺激，產(chǎn)品風(fēng)味也較差。兩種菌的最適溫度存在差異，所以對于不同溫度環(huán)境的適應(yīng)程度不同，生長繁殖和代謝的速度不同，溫度可能是影響鐵皮石斛發(fā)酵酒的品質(zhì)的重要因素之一。因此，綜合感官品質(zhì)考慮，確定最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.1.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)品品質(zhì)的影響

圖4 發(fā)酵時間對鐵皮石斛酒感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory evaluation of fermentedDendrobium candidumwine

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，鐵皮石斛發(fā)酵酒的感官評分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)發(fā)酵時間為7 d時，感官評分最高，為90.5分。這是由于前期鐵皮石斛發(fā)酵酒仍處于酸度和酒精度不斷增加的過程，因此整體呈現(xiàn)風(fēng)味不足，酸甜比失調(diào)，口感較差，而隨著發(fā)酵時間的延長，酸度和酒精度不斷增加，產(chǎn)品的香氣較為濃郁，色澤淺紅，酸味適中，酒味適宜，感官品分最佳，而其后延長發(fā)酵時間，產(chǎn)品的組織狀態(tài)較差，因此，感官稍有下降。結(jié)合生產(chǎn)成本的因素綜合考慮，確定最佳的發(fā)酵時間為7 d。

2.2 鐵皮石斛發(fā)酵酒工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，菌種活化液添加量對鐵皮石斛酒的感官評分影響相對較小，而且當(dāng)添加量達(dá)到2%時，其后增大菌種活化液添加量，鐵皮石斛發(fā)酵酒的感官評分變化不明顯，因此，選定菌種活化液添加量為2%。選取菌種配比（芽孢桿菌：釀酒酵母菌）（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）3個因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

由表3可知，3個因素對鐵皮石斛發(fā)酵酒感官評分影響的主次順序?yàn)锳＞B＞C，即菌種配比的影響最大，其次是發(fā)酵溫度，影響最小的為發(fā)酵時間。最優(yōu)組合為A2B2C2，即選用菌種配比為芽孢桿菌∶釀酒酵母菌為1∶10（V/V），發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時間為7 d，此時鐵皮石斛發(fā)酵酒的感官評分最高。

由表4可知，對于感官評分而言，僅有菌種配比對感官評分的影響顯著（P＜0.05），而發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的影響均不顯著。

表3 鐵皮石斛發(fā)酵酒發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentedDendrobium candidumwine fermentation process optimization

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table4 Variance analysis of orthogonal experiments

由于感官評分的最優(yōu)組合A2B2C2未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)組合中，因此，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果表明，A2B2C2組合處理下的鐵皮石斛發(fā)酵酒的總酸為9.3 g/L，酒精度為5.13%vol，感官評分可達(dá)97.5分，優(yōu)于正交試驗(yàn)表中各項(xiàng)處理組合，故A2B2C2為鐵皮石斛發(fā)酵酒的最佳工藝，即芽孢桿菌∶釀酒酵母菌的比例為1∶10（V/V），發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時間為7 d，按照此工藝條件生產(chǎn)的鐵皮石斛發(fā)酵酒口感酸味純正、酒度適宜、入口柔和；色澤呈現(xiàn)均勻的淺紅色，澄清透明、無雜質(zhì)；具有鐵皮石斛和發(fā)酵特有的風(fēng)味，香氣協(xié)調(diào)柔和宜人；組織狀態(tài)無分層，均勻一致，可溶性固形物含量為8%。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化鐵皮石斛發(fā)酵酒的發(fā)酵工藝條件為產(chǎn)乳酸芽孢桿菌∶釀酒酵母菌=1∶10（V/V），菌種活化液添加量2%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間7 d，此條件下發(fā)酵所得的鐵皮石斛發(fā)酵酒色澤均勻，呈淺紅色，酸度適宜，酒精度適宜，口感入口柔和，無分層無雜質(zhì)，具有鐵皮石斛發(fā)酵后特有的風(fēng)味，感官評分為97.5分，總酸含量9.3 g/L，酒精度5.13%vol。