李 志，焦彥朝，王興寧*

（1.六盤水市山地特色生態(tài)產(chǎn)品研究中心，貴州 六盤水 553000；2.貴陽海關(guān)出入境檢驗檢疫綜合技術(shù)中心國家果蔬檢測重點實驗室（六盤水），貴州 六盤水 553000；3.貴陽海關(guān)出入境檢驗檢疫綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081）

茶葉是世界三大飲料之一，而我國是世界茶葉產(chǎn)量第一大國，茶葉出口第二大國[1]，為了提高茶葉產(chǎn)量，農(nóng)藥在茶葉病蟲防治中得到了廣泛使用，但由于使用過程中存在濫用、誤用等現(xiàn)象，時常有殘留農(nóng)藥檢出或超標(biāo)的情況發(fā)生[2]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法結(jié)合了氣相色譜的高分辨率和質(zhì)譜的高靈敏度的特點，能同時進行定性、定量檢測分析，主要適用于分析沸點較低、熱穩(wěn)定性好且分子質(zhì)量較小的化合物[3]。近年來已有大量文獻報道氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測茶葉中農(nóng)藥多殘留的分析研究，如蘇建峰等[4]采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測茶葉及茶葉加工品中295種農(nóng)藥多殘留；榮杰峰等[5]采用羥基化多管壁碳納米管分散固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定茶葉中21種有機磷農(nóng)藥；在茶葉農(nóng)藥多殘留檢測中建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法，對正確合理使用農(nóng)藥、提升茶葉品質(zhì)具有重大意義。本實驗建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定茶葉中21種農(nóng)藥殘留，以期滿足日常的茶葉農(nóng)藥殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、正己烷（均為色譜純）：德國Merck公司；丙酮、甲苯（均為色譜純）：美國Tedia試劑公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純）：國藥集團化學(xué)有限公司；Cleanert TPT固相萃取柱：美國Agela公司。

21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL，1.2 mL）：中國計量院；水城春茶葉：水城縣茶葉發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-TQ8050氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配AOC-20i+s自動進樣器）、AUX220分析天平：日本島津公司；Talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器：美國Troemner公司；3-18K臺式高速冷凍離心機：德國Sigma公司；HG200均質(zhì)機：普利賽斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司；HSE-12B固相萃取儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；TWS-12電熱恒溫水浴鍋：上海喆圖科學(xué)儀器有限公司；MM400混合研磨儀：德國ReTsch萊馳公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取單個農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液（100 μg/mL，1.2 mL）各1 mL于3個10 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為10 μg/mL混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液，放于冰箱中冷藏，有效期為3個月。

分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 μL、100 μL、200 μL、500 μL、1 000 μL于10 mL容量瓶中，并用丙酮定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，定量離子對的峰面積（y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得到各組分線性方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g試樣（精確至0.000 1 g），于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，分別以回流法、超聲法、旋渦振蕩法提取，提取液以5 000 r/min離心5 min，取上清液于250 mL茄型瓶中。殘渣再次用15 mL乙腈重復(fù)提取一次，離心，合并提取液，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1 mL，待凈化。

在CleanertTPT固相萃取柱中加入約2cm無水硫酸鈉，用10 mL乙腈-甲苯（3+1，體積比）預(yù)洗Cleanert TPT固相萃取柱，棄去流出液，放入固定架上。將上述樣品濃縮液轉(zhuǎn)移至Cleanert TPT固相萃取柱中，用2 mL乙腈-甲苯洗滌樣品瓶，并將洗滌液移入柱中，重復(fù)3次，再用25 mL乙腈-甲苯洗滌小柱，收集上述所有流出溶液于茄型瓶中，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至0.5mL左右，加入5mL正己烷進行溶劑交換，重復(fù)上述操作兩次，最終的樣品液體積約為1 mL，用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度60℃，保持1 min，以25℃/min的速率升溫至160℃，再以5℃/min的速率升溫至250℃，最后以10℃/min的速率升溫至300℃，保持10min；載氣為氦氣（He）（純度≥99.999%），流速1.2 mL/min；進樣口溫度290℃；進樣量1.0 μL；進樣方式：不分流進樣。電離方式為電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；GC-MS接口溫度280℃；駐留時間2.5 min；溶劑延遲時間3 min；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），參數(shù)見表1。

表1 21種農(nóng)藥組分CAS號、MRM參數(shù)Table1 CAS No.and MRM parameters for 21 kinds of pesticides

續(xù)表

1.3.4 回收率[6-7]

采用加標(biāo)回收率對提取方法、提取溶劑、樣品濃縮方法進行評價，其計算公式：

式中：X為回收率，%；As為各農(nóng)藥添加到樣品中所測得實際含量，mg/kg；Ap為空白樣品中各農(nóng)藥的含量，mg/kg；Aa為各農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)添加量，mg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 21種農(nóng)藥混標(biāo)溶液總離子流色譜圖及線性回歸方程

21種農(nóng)藥混標(biāo)溶液總離子流色譜圖（total ions chromatogram，TIC）如圖1所示；保留時間和線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)R2見表2。

圖1 21種混合農(nóng)藥標(biāo)品GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the 21 kinds of pesticides mixture standards analysis by GC-MS

表2 21種農(nóng)藥標(biāo)品的保留時間、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table2 Retention time,linear regression equation and correlation coefficient of 21 kinds of pesticides standards

由表2可知，在確定色譜柱及儀器分析條件下，21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品在0.05～1.00 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.998。

2.2 提取方法的考察

超聲提取是利用超聲波的機械效應(yīng)和空化效應(yīng)使其樣品細胞破裂[8-12]，從而使提取物溶于溶劑達到提取目的；旋渦振蕩提取是利用旋渦混合器劇烈振蕩，加速提取物溶于溶劑；回流浸提是利用溶質(zhì)通過細胞壁的滲透作用，從而完成提取。在相同時間內(nèi)采取不同的提取方法提取，各農(nóng)藥回收率如表3所示。由表3可知，超聲提取回收率在3種提取方法中最高，其次是旋渦振蕩提取，回流法提取回收率最低，因此，選超聲提取為宜。

表3 不同提取方法對回收率的影響Table3 Effect of different extraction methods on recovery rate

2.3 提取溶劑的考察

茶葉中農(nóng)藥檢測常用的提取溶劑有乙腈、正己烷-丙酮混合溶劑、乙酸乙酯等，不同溶劑對農(nóng)藥殘留的提取效率有一定影響[13-14]。本研究采用超聲提取方法及等劑量的提取溶劑，對比乙腈、正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑、乙酸乙酯這3種溶劑的提取效果，得到了不同提取溶劑與相應(yīng)農(nóng)藥的回收率如表4所示。由表4可知，乙腈與正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑提取效果相當(dāng)，乙酸乙酯次之，平均回收率分別是89.24%、90.05%、86.81%，但因乙腈濃縮速度慢、毒性高，故正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑為優(yōu)選提取溶劑。

表4 不同提取溶劑對回收率的影響Table4 Effect of different extraction solvents on recovery rate

2.4 樣品濃縮方式的考察

樣品濃縮方式不同對農(nóng)藥的測定有較大影響[15-17]。本試驗分別考察水浴蒸發(fā)濃縮、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、氮吹濃縮等對茶葉回收率的影響，如表5所示。由表5可知，3種不同濃縮方式得到的平均回收率分別是80.62%、82.81%、88.19%，氮吹濃縮得到的平均回收率最高，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮次之，水浴蒸發(fā)濃縮最低。水浴蒸發(fā)濃縮因溫度過高可能導(dǎo)致農(nóng)藥發(fā)生降解，故回收率在3種濃縮方式中最低；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮可能因濃縮過程中提取液與濃縮瓶壁接觸面積過大，一部分農(nóng)藥附著在瓶壁上而未被最終的溶劑沖洗下來，從而導(dǎo)致回收率相對較低。故選擇氮吹濃縮為宜。

表5 不同濃縮方法對回收率的影響Table5 Effect of different concentration methods on recovery rate

2.5 茶葉中21種農(nóng)藥殘留檢出限、精密度和回收率試驗

以空白基質(zhì)產(chǎn)生3倍信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）計算檢出限[18-22]，用mg/kg表示。分別向空白茶葉基質(zhì)中添加1 mL 0.25 μg/mL、1.00 μg/mL及2.00 μg/mL的21種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其樣品中分別含有0.05、0.20和0.40 mg/kg的3個水平，每個水平重復(fù)測定6次，檢出限、回收率和精密度測定結(jié)果見表6。由表6可知，茶葉樣品中21種農(nóng)藥殘留的檢出限為0.002 7～0.021 7 mg/kg，平均回收率為83.46%～92.13%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為4.88%～8.51%。

表6 茶葉中21種有機農(nóng)藥檢出限、回收率和精密度試驗Table6 Detection limits,recovery rates and precision of 21 kinds of organic pesticides in tea

續(xù)表

2.6 實際樣品的檢測

選水城春茶葉作為檢測樣品，按照所建立檢測方法對其進行21種農(nóng)藥測定，檢測結(jié)果見表7。由表7可知，水城春茶葉中檢出5種農(nóng)藥，分別是速滅磷0.023 mg/kg、甲胺磷0.043 mg/kg、毒死蜱0.038 mg/kg、喹硫磷0.013 mg/kg、噠螨靈0.021 mg/kg。

表7 實際茶葉樣品的檢測結(jié)果Table7 Determination results of tea samples

3 結(jié)論

通過對茶葉提取方法、提取溶劑、濃縮方式步驟的優(yōu)化，建立了一種高效、簡單的測定茶葉中21種農(nóng)藥殘留檢測方法。該方法選用正己烷-丙酮（1∶1，V/V）混合溶劑進行超聲提取，提取液用氮吹儀進行濃縮至1～2 mL過Cleanert TPT固相萃取柱凈化，用乙腈-甲苯（3∶1，V/V）洗脫，濃縮至1 mL進行GC-MS分析。該方法的平均回收率為83.46%～92.13%，RSD為4.88%～8.51%，檢出限為0.002 7～0.021 7 mg/kg。與其他農(nóng)藥殘留檢測方法比，具有提取效率高、溶劑用量少、操作簡單等優(yōu)點，在實際茶葉農(nóng)藥殘留檢測中得到了廣泛應(yīng)用，能滿足日常的茶葉農(nóng)藥殘留檢測。