劉彩婷，周鴻翔*，王曉丹，陳 碩，唐開永

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

藍(lán)莓是超強(qiáng)抗氧化活性成分花色苷最豐富的膳食來源之一[1]，且富含多種具有藥理保健功效的成分，是國際糧農(nóng)組織列出的人類五大健康食品之一，被譽(yù)為“水果皇后”[2]。藍(lán)莓多在高溫多雨的季節(jié)成熟且保質(zhì)期短極易腐爛，但時(shí)至今日藍(lán)莓貯藏、加工等環(huán)節(jié)均缺乏規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化運(yùn)作，另外，目前國內(nèi)市場上藍(lán)莓果酒產(chǎn)品還較為少見，歐美等國用藍(lán)莓加工的所有產(chǎn)品都遠(yuǎn)高于其他同類產(chǎn)品，發(fā)酵果酒更是成為高收入人群的奢侈品[3]。而蘋果這種喜聞樂見的水果不但富含多種營養(yǎng)成分也具有美容養(yǎng)顏等保健功效[4-5]，且蘋果酒在國際上早已是大眾流通商品[6]。隨著消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，近年來市面上復(fù)合型果酒也相繼出現(xiàn)，如藍(lán)莓獼猴桃、蘋果杏鮑菇、銀杏火龍果、藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒等[7-10]，復(fù)合后的發(fā)酵果酒不但保留了各自營養(yǎng)成分，還在口感、風(fēng)味、品質(zhì)方面彌補(bǔ)了單一品種果酒的不足；如藍(lán)莓酒果香濃郁但普遍存在偏酸性的特點(diǎn)，而蘋果具有酸度低，單寧含量低的特點(diǎn)，但口感單薄[11]，因此將兩者復(fù)合發(fā)酵不但可以取長補(bǔ)短，還能提高其附加值，而且，此款果酒在國內(nèi)外市面上還較為鮮見，綜上，藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒也將擁有廣泛發(fā)展前景的基礎(chǔ)。

但目前國內(nèi)外藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒的釀造過程中，大多采用葡萄酒通用酵母，幾乎沒有特別適合的專用酵母，在一定程度上造成了風(fēng)味偏于平淡，無法突出其獨(dú)特口感和香氣。果酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生物轉(zhuǎn)化過程，其酵母主導(dǎo)的酒精發(fā)酵是果酒生產(chǎn)最重要階段之一；并且不同酵母菌株會(huì)產(chǎn)生部分特定代謝物質(zhì)，在原料品種、工藝條件、釀酒設(shè)備相對穩(wěn)定的情況下，酵母菌種直接影響著果酒的色澤、香氣及口感；因此，本研究選用可突出水果香氣特征、增強(qiáng)果香的DO02酵母、具有強(qiáng)花青素和單寧浸提能力的D254酵母、能產(chǎn)生大量水解多糖、芳香細(xì)致的JK10酵母、可釋放品種香氣特質(zhì)的Vitilevure KD酵母、富產(chǎn)多糖、果香濃郁的JK13酵母及實(shí)驗(yàn)室原有酵母DO03、BV818、ADT，制備藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒。選用8種國內(nèi)外商業(yè)酵母，對比各種酵母發(fā)酵過程中總酸、總糖、還原糖含量的變化規(guī)律，分析藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒感官指標(biāo)和理化指標(biāo)，并采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（headspacesolid-phasemicroextraction-gaschromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）法檢測其香氣組分。結(jié)合感官評分和頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用（HSSPME-GC-MS）技術(shù)對各香氣組分含量進(jìn)行分析，從而找到藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒的最佳酵母，為該果酒特色和品牌形成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

國產(chǎn)酵母（DO02、DO03、BV818、ADT）、進(jìn)口酵母（JK10、D254、VitilevureKD（KD）、JK13）：煙臺(tái)帝伯仕有限公司；純凈水：貴州北極熊集團(tuán)；藍(lán)莓汁和蘋果汁：市售100%純果汁。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡糖糖、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉：成都金山化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸：重慶川東化工科技有限公司；碘標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：山東綠英化工科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722S可見光分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、CP-WAX 57CB色譜柱（50 m×250 μm×0.20 μm）：美國安捷倫科技有限公司；50/30 μm萃取頭DVB/CAR/PDMS Stable Flex：美國Supelco公司；PHS-3C精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

發(fā)酵液調(diào)配[12]：以藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒酒精度14%vol為前提，藍(lán)莓汁和蘋果汁以1∶1的比例調(diào)配，適量加糖并以純凈水稀釋調(diào)整發(fā)酵液糖度。

裝入容器：將調(diào)配好的發(fā)酵液裝入三角瓶容器中，約占容器的3/4左右。

接種：干酵母用量為0.34‰[11，13-14]，以料液比1∶10（g∶mL）加入0.5%蔗糖水，30～37℃活化15～20 min，接種活化好的酵母種子液，并適當(dāng)攪拌使其與料液充分混合，并增加溶氧量。

發(fā)酵：將樣品置于25℃恒溫發(fā)酵，前36～48 h紗布封口，適當(dāng)攪拌，待發(fā)酵液有酒精味產(chǎn)生，或酵母活菌數(shù)約為107CFU/mL，以硅膠單向閥取代紗布繼續(xù)發(fā)酵；發(fā)酵過程每隔2 d監(jiān)測一次總糖、總酸、還原糖含量，當(dāng)還原糖含量≤10 g/L或檢測數(shù)據(jù)連續(xù)3次基本保持穩(wěn)定時(shí)，視作發(fā)酵終點(diǎn)。

過濾：發(fā)酵液使用濾膜為120目過濾機(jī)過濾。

裝瓶：將過濾后的果酒迅速裝瓶，打塞密封，得到藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒。

1.3.2 理化檢測

總糖、還原糖含量測定：3,5-二硝基水楊酸法[15]；總酸含量測定：參照國標(biāo)GB/T 32783—2016《藍(lán)莓酒》[16]；酒精度、揮發(fā)酸、干浸出物含量測定：參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]。

1.3.3 感官評分

以本院老師、學(xué)生和企業(yè)代表為參評人員參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[12]進(jìn)行感官評分，滿分100分，藍(lán)莓蘋果評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table1 Sensory evaluation standards of blueberry-apple compound fruit wine

1.3.4香氣成分分析

采用HS-SPME-GC-MS法提取樣品香氣成分[17-18]。向各個(gè)裝有5mL酵母果酒樣品的10mL頂空瓶中分別加入2g的NaCl，擰蓋備用。萃取頭老化15min，孵化溫度50℃，萃取時(shí)間30min，振搖速度450r/min，解吸5 min，進(jìn)行GC-MS 檢測分析。

GC條件：以高純氦氣（He）為載氣，流速1.0 mL/min；加熱器溫度200℃；柱箱溫度55℃，升溫程序：以3℃/min從55℃升至70℃保持1 min，以3℃/min升至115℃保持1 min，以4℃/min升至200℃保持3 min。

MS條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，掃描方式為全掃描。

定性定量分析：樣品中未知揮發(fā)性組分通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technol ogy，NIST）2011圖庫比對、分析，保留匹配度＞80%的物質(zhì)；采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對百分含量[19]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用office Excel、GraphPad、Oringin8.0和SPSS18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析、作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程總糖含量變化

8種酵母發(fā)酵期間總糖含量變化結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵過程中總糖含量變化Fig.1 Change of total sugar contents during fermentation process

由圖1可知，以總糖余量＜10 g/L作為發(fā)酵結(jié)束來看，國產(chǎn)酵母與進(jìn)口酵母總糖含量分別于發(fā)酵4～8 d和2～6 d迅速下降，之后則以緩慢下降趨勢至發(fā)酵結(jié)束，可知進(jìn)口酵母環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)且進(jìn)入大量繁殖期早；由于國產(chǎn)酵母BV818周期最短（28 d），進(jìn)口酵母JK10周期最長（28 d），綜上，從總糖含量的變化可以得出，本次試驗(yàn)8種酵母中，在發(fā)酵速率方面進(jìn)口酵母整體優(yōu)于國產(chǎn)酵母。

另外，在發(fā)酵前期，所有酵母總糖含量下降趨勢陡峭，這是因?yàn)榻湍富罹鷶?shù)驟增，大量利用糖分促進(jìn)自身生長繁殖同時(shí)又以糖為發(fā)酵底物進(jìn)行酒精發(fā)酵所致[20]，而發(fā)酵一段時(shí)間后下降趨勢趨于緩和，這是由于酵母進(jìn)入平穩(wěn)期，糖分利用率減緩，且隨著酒精含量上升酵母菌也受到了乙醇脅迫[21]，且?guī)缀鯖]有總糖殘量為零的現(xiàn)象，可能因酵母逐漸進(jìn)入衰退期，總糖無法被利用，從而出現(xiàn)下降趨勢趨于停滯，最終導(dǎo)致酒精發(fā)酵結(jié)束。

2.2 發(fā)酵過程還原糖含量變化

8種酵母發(fā)酵期間還原糖含量變化結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.2 Change of reducing sugar contents during fermentation process

由圖2可知，還原糖含量變化大致趨同于總糖含量變化趨勢，但進(jìn)口酵母在發(fā)酵15 d后含糖量下降趨勢才出現(xiàn)緩和，而國產(chǎn)酵母則從第12天便在相對于同期進(jìn)口酵母殘?zhí)橇慷啾兜幕A(chǔ)上開始緩慢下降趨勢，而這種現(xiàn)象也與整個(gè)發(fā)酵周期長短相符合，就還原糖含量變化來看，本次試驗(yàn)8種受試酵母中，進(jìn)口酵母JK10、D254、KD相對較好。

經(jīng)比對還原糖和總糖含量的變化，大部分酵母同期還原糖量有高于總糖的現(xiàn)象，推測在測定總糖時(shí)添加的鹽酸使總糖被破壞，而測定的還原糖一部分源于樣品本身，另一部分源于蔗糖經(jīng)酸水解后生成的還原糖，由此可認(rèn)為還原糖相對于總糖能更準(zhǔn)確地反映出發(fā)酵液殘?zhí)橇孔兓闆r，因而更具代表性。

2.3 發(fā)酵過程總酸含量變化

8種酵母發(fā)酵期間總酸含量變化結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig.3 Change of total acid contents during fermentation process

總酸指果酒中所有可與堿發(fā)生中和反應(yīng)的酸的總和，與果酒風(fēng)味有很大關(guān)系[22]。由圖3可知，8種酒樣總酸含量均＞4.0 g/L，其中酵母JK10、DO03、BV818、ADT雖前期總酸含量增加，但整體而言，變化幅度相對較小，總酸相對穩(wěn)定。另外，發(fā)酵前期總酸含量一直增加，一方面是原料自身含有的有機(jī)酸積累，另一方面發(fā)酵液中產(chǎn)酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生醋酸、丁酸、乳酸等[23]，以及酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的二氧化碳如未能及時(shí)放出也會(huì)增加碳酸含量，這些原因都促使了有機(jī)酸大量積累；而當(dāng)發(fā)酵至12 d左右時(shí)，總酸含量呈緩慢下降趨勢，這可能是隨著發(fā)酵時(shí)間推移積累的有機(jī)酸和生成的乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，酸有所消耗的緣故。

2.4 不同酵母發(fā)酵藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒的理化指標(biāo)

8種酵母發(fā)酵液在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的理化指標(biāo)見圖4。

圖4 八種商業(yè)酵母發(fā)酵藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒理化指標(biāo)檢測結(jié)果Fig.4 Determination results of physiochemical indexes of blueberry-apple compound fruit wine fermented by eight kinds of commercial yeasts

由圖4A可知，因干浸出物直接影響果酒香氣滋味，其含量對果酒風(fēng)味影響較大，酵母JK13在8種酒樣中含量最低，且差異顯著（P＜0.05）；由圖4B可知，酵母DO03、JK10、D254、JK13、KD酒精轉(zhuǎn)化能力高于酵母DO02、BV818、ADT；由圖4C可知，一般果酒中揮發(fā)酸主要以乙酸為主，而發(fā)酵異常或被雜菌污染有可能使其在酒中過度累積產(chǎn)生刺激性氣味使酒體口感尖酸[27]。酵母BV818、D254、JK13、KD的酒樣中揮發(fā)酸含量較低，酵母DO03、ADT、JK10含量稍高，但也低于GB/T 32783—2016《藍(lán)莓酒》中揮發(fā)酸含量≤1.2 g/L的要求。由圖4D可知，酵母JK13總酸含量最低，差異顯著（P＜0.05），酵母ADT、KD總酸含量相對較高，與其他6種酒樣差異顯著（P＜0.05），而酵母DO02、DO03、BV818、D254、JK10總酸含量居中，適口性更強(qiáng)。

2.5 藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒香氣成分分析

8種酵母發(fā)酵液在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)對其香氣成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 八種藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table2 Analysis results of aroma components in eight kinds of blueberry-apple compound fruit wine analyzed by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

由表2可知，國產(chǎn)酵母DO02、DO03、BV818、ADT發(fā)酵液中分別檢測到52種、51種、52種、48種香氣物質(zhì)，進(jìn)口酵母JK10、D254、JK13、KD分別檢測到58種、49種、45種和40種。由此可知酵母JK10具有產(chǎn)香相對優(yōu)勢，雖8種復(fù)合果酒存在差異，但酯類作為果酒最重要的香氣物質(zhì)，其己酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、苯甲酸乙酯為共有物質(zhì)。本次檢測中具有椰香味的癸酸乙酯含量最多且大部分酒樣總峰面積占比＞20%；其中酵母DO02酯類總峰面積占比高達(dá)到57.27%，在所檢測的香氣成分中占比65%，故而在香氣方面理論上更為濃郁。

部分醇類可為酒體提供清甜果香和花香，而萜烯類組分雖感官閾值較低，含量低，但香氣很明顯，氣味獨(dú)特，為果酒香氣組成起到不可忽視的作用。其中酵母JK10的醇類總峰面積占比高達(dá)到53.260%，在所檢測到的香氣成分中占比61%，其獨(dú)有的D-橙花腦醇、3-苯丙醇、反式-1-苯基-1-醇、2-乙氨基乙硫醇使其香氣復(fù)雜，也正因此在感官評定中分值較高。

酸類化合物的存在不但能豐富果酒口感還有助于原反應(yīng)的發(fā)生，從而平衡酒體香氣，使口感更具層次感和飽滿性。如辛酸雖然具有令人不愉快氣味，但可與醇類生成酯類，是提高果酒品質(zhì)的重要保障，但酸類物質(zhì)過多則會(huì)使酒體酸澀，其中，酵母DO02酸類物質(zhì)占比最高7.76%。

果酒中羰基化合物大多由微生物發(fā)酵而成，通過化學(xué)變化生成乙醛、乙醇、異戊醇和仲戊醇等，在多種醇類物質(zhì)催化作用下形成乙縮醛，它對提高酒體整體風(fēng)味有著顯著作用；而酚類這種復(fù)雜基團(tuán)化合物也是一種極其重要的揮發(fā)性芳香類物質(zhì)；雖兩者閾值較低，酒液中的含量也很低，但兩者對酒體的滋味、香氣和微生物穩(wěn)定性均起著難以替代的作用。

綜上，藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒香氣成分種類多樣，且很多香氣成分有著類似香氣氣味，因此可以在對每種香氣成分香氣特征清晰了解的基礎(chǔ)上精確定量分析，或進(jìn)一步借助氣相色譜-嗅聞（gaschromatography-olfactometry，GC-O）法、香氣活度值（odor activity value，OAV）法等對香氣成分進(jìn)一步分析，從而為藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒的特色和品牌形成提供理論基礎(chǔ)。

2.6 藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒感官評定

表3 八種商業(yè)酵母發(fā)酵藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒感官評定結(jié)果Table3 Sensory evaluation results of blueberry-apple compound fruit wine fermented by eight kinds of commercial yeasts

由表3可知，國產(chǎn)酵母中DO02分值最高（84.5分）；進(jìn)口酵母中JK10分值最高（87.0分）。酵母KD感官評分最低（81.5分），酵母BV818、D254、JK13及ADT感官評分在83.0～84.3分。結(jié)果表明，酵母DO02和JK10感官品質(zhì)較好。

3 結(jié)論

以藍(lán)莓汁和蘋果汁為原料，選用8種國內(nèi)外商業(yè)酵母，對比各種酵母發(fā)酵過程中總酸、總糖、還原糖含量的變化規(guī)律，分析藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒感官指標(biāo)和理化指標(biāo)，并采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）法檢測其香氣組分。結(jié)果表明，8種酵母發(fā)酵藍(lán)莓蘋果復(fù)合果理化指標(biāo)均符合相關(guān)國標(biāo)的要求，其中酵母JK10是制備藍(lán)莓蘋果復(fù)合果酒最佳釀酒酵母，成品各理化指標(biāo)均符合GB/T 32783—2016《藍(lán)莓酒》相關(guān)要求，感官評分最高87.0分，酒精度為14.9%vol，共檢測到58種香氣物質(zhì)，為其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。