郭 鶴，徐莉佳，葉 勤，陶怡曦，蘇 英，吳榮華，3，李 云，3

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶400715；2.西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶，400715；3.西南大學(xué)淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶400715)

增殖放流中關(guān)鍵的組成部分是標(biāo)志與回捕鑒定技術(shù)[1]。目前，魚類標(biāo)志技術(shù)主要有外部、內(nèi)部、化學(xué)、生物和分子標(biāo)記等主要種類[2-3]。化學(xué)標(biāo)記技術(shù)可在短期內(nèi)標(biāo)記大量魚種，并且具有效果顯著、成本低、對標(biāo)記對象傷害較小的優(yōu)點(diǎn)，故在漁業(yè)增殖放流和水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了更廣泛的應(yīng)用和發(fā)展[4]。其中，熒光染料技術(shù)利用熒光物質(zhì)可在魚體的鈣化組織(如鱗片、耳石、鰭條等)上沉積以產(chǎn)生熒光標(biāo)記的特點(diǎn)，已在標(biāo)記生長率調(diào)查、年齡確認(rèn)和種群與區(qū)域鑒定方面的研究中得到了較好的應(yīng)用[5-8]。目前，鹽酸四環(huán)素(TCH)、茜素、茜素絡(luò)合物、鈣黃綠素等熒光染料已被廣泛應(yīng)用于魚類的增殖放流標(biāo)記，不同魚類對不同染料的耐受性和敏感性也存在較大差異[9-12]。

TCH因其具有價格低、標(biāo)記效果顯著、標(biāo)記時間持久等特點(diǎn)，已在國內(nèi)外使用40余年[13-15]。熒光染料標(biāo)記法雖效果顯著，但高濃度和較長時間的浸泡可能對標(biāo)記魚類產(chǎn)生生理脅迫，對機(jī)體造成不同程度的損傷進(jìn)而影響其生長、發(fā)育、行為，最終造成死亡[16-17]。而熒光染料標(biāo)記對魚類是否會造成生理脅迫和損傷等方面的相關(guān)報道甚少，多數(shù)研究主要還是側(cè)重?zé)晒馊玖蠘?biāo)記魚類的效果和持久度。斑馬魚作為一種模式生物，由于其個體小，繁殖發(fā)育周期短，胚胎透明易于觀察，特別是實(shí)驗品系具有遺傳背景相同，對藥物反應(yīng)具有一致性等特點(diǎn)，被廣泛用做毒理實(shí)驗?zāi)Ｐ蚚18]。因此，本研究以斑馬魚為研究對象，考察其對TCH染料的敏感性以及在不同濃度和浸泡時間下的標(biāo)記效果和抗氧化酶活性的影響，并對TCH標(biāo)記魚類進(jìn)行效果和安全評估。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗魚

本實(shí)驗室自行培養(yǎng)和繁殖的野生AB系斑馬魚稚魚(平均體長10 mm，25日齡)。養(yǎng)殖水溫為28.5 ℃，光周期為14 L∶10 D，每天定時投喂兩次且浸泡前后均保持正常投喂和相同光照條件。飼養(yǎng)方法參照《The Zebrafish Book》[19]。

1.2 熒光標(biāo)記浸泡方法

將TCH試劑(上海生工生物工程公司)與養(yǎng)殖水體按比例混勻，制備成體積為10 L，濃度分別為0(對照組)、100、150、250 mg/L的TCH浸泡液，pH均調(diào)至7.0。隨后每組中各加入200尾健康的斑馬魚稚魚，使浸泡密度為20尾/L。

1.3 樣品處理

浸泡后的第1、3、6、9、15、30 d，取出各濃度處理組的斑馬魚矢耳石和微耳石，清洗后置于熒光顯微鏡(Leica DMIL LED)下進(jìn)行觀察和拍照。參照歐陽斌等[20]的研究方法確定耳石的標(biāo)記效果。同樣時間點(diǎn)，隨機(jī)取各濃度和浸泡時間處理組的12尾稚魚，按照1∶9的質(zhì)量體積比，加入配制好并預(yù)冷的淡水魚用生理鹽水。在冰上進(jìn)行勻漿處理后，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速于冷凍離心機(jī)(4℃)中離心10 min，取上清液檢測。用SOD、CAT、GSH-P x和總蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所)測定抗氧化酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗結(jié)果用回歸方法做相關(guān)性檢驗，采用單因素方差分析法(One-Way ANOVA)和最小極差法(LSD)進(jìn)行分析和比較組間差異平均值，統(tǒng)計結(jié)果中P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCH標(biāo)記斑馬魚耳石的效果

在綠色激發(fā)光N2.1和藍(lán)色激發(fā)光I3下觀察斑馬魚耳石的標(biāo)記效果[21]。結(jié)果顯示，150 mg/L和250 mg/L 的TCH浸泡液對斑馬魚耳石標(biāo)記率均為100%，TCH對斑馬魚微耳石的標(biāo)記效果比矢耳石的標(biāo)記效果明顯(表1)。

斑馬魚微耳石的熒光照片顯示如圖1，(矢耳石的熒光圖略)，濃度為0、100、150、250 mg/L TCH浸泡18 h(1-A)和24 h(2-A)，耳石的熒光標(biāo)記強(qiáng)度與濃度呈正相關(guān)。浸泡18 h時，250 mg/L濃度的TCH浸泡液標(biāo)記斑馬魚耳石的效果最好。浸泡24 h時，150 mg/L和250 mg/L濃度組的標(biāo)記效果均很明顯，標(biāo)記輪紋在第15 d時就已非常清晰(2-15A)。

表1 TCH浸泡標(biāo)記斑馬魚耳石的效果Tab.1 Results of otolith marking in Danio rerio with TCH immersion

2.2 TCH標(biāo)記后斑馬魚的抗氧化酶活性的變化

2.2.1 SOD活性的變化

100 mg/L濃度處理組浸泡18 h的斑馬魚的SOD活性，在浸泡后的第1、3、6、9、15 d均與對照組無顯著性差異；150 mg/L處理組的SOD活性在第3 d時顯著升高，在第6 d時達(dá)到最大值；250 mg/L處理組在第3 d時SOD活性達(dá)到最大，在第15 d時恢復(fù)到對照組水平。

浸泡時間為24 h，中低濃度組(100 mg/L、150 mg/L)斑馬魚在浸泡后的第1 d，SOD活性有極顯著的提高，高濃度組SOD活性在第1 d時顯著降低，但在第3 d時顯著升高。在隨后各時間點(diǎn)的檢測中，各濃度處理組SOD活性隨時間呈下降趨勢，最終在15 d時恢復(fù)到對照組水平。結(jié)果表明，延長浸泡時間，加快了斑馬魚體內(nèi)SOD活性的誘導(dǎo)，但高濃度長時間的浸泡可能會短暫抑制其酶活性，對魚體造成短期內(nèi)可恢復(fù)的氧化損傷。

圖1 不同濃度TCH溶液浸泡處理18 h和24 h后1、15、30 d的微耳石熒光標(biāo)記圖Fig.1 Fluorescencephotomicrographs of lapilli at 1， 15， 30 days after immersion for 18 hours and 24 hours in different concentrations of TCH solution

圖2 TCH 浸泡處理18 h和24 h后斑馬魚SOD活性的變化(*P<0.05， **P<0.01為與對照組比較檢驗，下同)Fig.2 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on SOD activity in Danio rerio

2.2.2 CAT活性的變化

100 mg/L和150 mg/L濃度TCH浸泡斑馬魚18 h，對其CAT活性無顯著影響；250 mg/L處理組的CAT活性在浸泡后的第3 d顯著升高。浸泡時間為24 h時，各濃度處理組在第3 d時的CAT活性均極顯著升高。在第9 d時，中低濃度組的CAT活性恢復(fù)為對照組水平，而高濃度組的CAT活性顯著低于對照組，在15 d時才恢復(fù)正常，表現(xiàn)出先誘導(dǎo)后抑制再恢復(fù)的趨勢。這一結(jié)果表明，用250 mg/L濃度TCH浸泡24 h可能對魚體產(chǎn)生了一定氧化損傷，但并非不可逆的氧化損傷。

圖3 TCH 浸泡處理18 h和24 h后斑馬魚CAT活性的變化Fig.3 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on CAT activity in Danio rerio

2.3.3 GSH-Px活性的變化

浸泡處理18 h后，100 mg/L TCH處理組的GSH-Px活性在各個時間點(diǎn)均與對照組無顯著差異；150 mg/L和250 mg/L處理組的GSH-Px活性均在第1 d被顯著誘導(dǎo)升高，并分別在第6 d和第3 d 時GSH-Px活性達(dá)到最大，在第9天時降低，但150 mg/L濃度處理組GSH-Px活性在第9天時仍然為顯著升高狀態(tài)，最終均在第15天時恢復(fù)至對照組水平。

浸泡時間延長后，100 mg/L濃度組的GSH-Px活性被誘導(dǎo)，在浸泡后的第3天時顯著升高并達(dá)到最大值；250 mg/L濃度處理組GSH-Px活性在第1、3、6、9天均被顯著誘導(dǎo)升高，誘導(dǎo)持續(xù)時間明顯延長。在第15天時，各濃度組GSH-Px活性均恢復(fù)為對照組水平。結(jié)果表明，延長浸泡時間至24 h后，GSH-Px活性出現(xiàn)被誘導(dǎo)現(xiàn)象開始的時間會隨浸泡液濃度的升高而提前。

圖4 TCH浸泡處理18 h和24 h后斑馬魚GSH-Px活性的變化Fig.4 Changes of 18 hour and 24 hour immersion treatment of TCH on GSH-Px activity in Danio rerio

3 討論

3.1 TCH標(biāo)記斑馬魚耳石的效果

熒光染料可實(shí)現(xiàn)大量增殖放流魚種的快速標(biāo)記，且標(biāo)記持續(xù)時間較長。但同時不能忽視熒光染料的濃度及浸泡時間對魚類造成的脅迫和生理損傷[21-22]。不可逆的生理損傷和高強(qiáng)度的環(huán)境因子脅迫均可增加魚種的死亡率，從而導(dǎo)致增殖放流效果不理想。本實(shí)驗結(jié)果表明，150 mg/L 和250 mg/L 濃度的TCH對斑馬魚耳石的標(biāo)記效果明顯。綜合考慮到成本、標(biāo)記效率及效果，標(biāo)記時可采用250 mg/L濃度TCH浸泡18 h或150 mg/L濃度TCH浸泡24 h的方法。以往也有研究表明，四環(huán)素標(biāo)記稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、彭澤鯽(Carassiusauratusvar.Pengze)[20]和許氏平鮋(Sebastesschlegelii)[23]的效果較好。因此，推測TCH熒光標(biāo)記可以應(yīng)用于其他魚類的標(biāo)記，并且可為后續(xù)的追蹤和調(diào)查提供準(zhǔn)確的標(biāo)記信息。

3.2 TCH標(biāo)記對斑馬魚的抗氧化酶活性的影響

高濃度的抗生素會對水生生物產(chǎn)生毒害作用，TCH作為一種抗生素，必然會在生態(tài)安全性方面受到更多關(guān)注[24]。章強(qiáng)[25]研究表明，四環(huán)素96 h的急性暴露，明顯抑制了斑馬魚胚胎的生長發(fā)育，并且四環(huán)素(10～200 μg/L)導(dǎo)致斑馬魚幼魚SOD和CAT基因表達(dá)量顯著上調(diào)，體內(nèi)ROS含量明顯上升。活性氧(ROS)主要包含超氧陰離子(·O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥自由基(·OH)。當(dāng)魚體受環(huán)境脅迫因子刺激時會產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，其體內(nèi)的抗氧化酶SOD和CAT會催化O2-和H2O2發(fā)生歧化反應(yīng)，防止有害物質(zhì)·OH的生成，GSH-Px可被H2O2氧化生成H2O，同時將還原性谷胱甘肽(GSSG)變成氧化型谷胱甘肽(GSH)。當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重脅迫時，抗氧化酶活性被抑制，導(dǎo)致體內(nèi)大量的ROS無法被及時清除，從而對脂類、蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生不可逆損傷[26-27]。因此，機(jī)體的抗氧化酶活性能有效反映出外源因子對機(jī)體脅迫和損傷的狀況[28-30]。

本研究結(jié)果顯示，各濃度處理組主要誘導(dǎo)了斑馬魚的抗氧化酶活性提高，出現(xiàn)低濃度誘導(dǎo)，高濃度抑制的現(xiàn)象，但總體上抗氧化酶活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)升高而后隨時間延長呈逐漸恢復(fù)為對照水平的趨勢，這與四環(huán)素對纖毛蟲(Ciliate)[31]、銅綠微囊藻(Microcysitisaeruginosa)[32]抗氧化酶活性影響的結(jié)果相似。吳金明等[33]對茜素紅標(biāo)記中華倒刺鲃(SpinibarbusSinensis)抗氧化酶活性影響的研究中也得到了相似的結(jié)果。本實(shí)驗中，150 mg/L濃度組的抗氧化酶活性被誘導(dǎo)的時間遲于250 mg/L濃度組，并且恢復(fù)至正常水平的時間相對于高濃度組滯后，可能由于高濃度的TCH溶液刺激魚體內(nèi)SOD和GSH-Px抗氧化酶產(chǎn)生協(xié)同作用，快速清除體內(nèi)多余的氧自由基，縮短酶活性恢復(fù)至正常水平的時間。另外，本實(shí)驗中SOD和GSH-Px活性的誘導(dǎo)呈現(xiàn)出同步性，CAT活性的誘導(dǎo)相對滯后，可能是由于CAT與SOD和GSH-Px的響應(yīng)模式不同。Livingstone等[34]在沙丁魚上也觀察到SOD與CAT的響應(yīng)模式不相同的現(xiàn)象。

本研究中，低濃度TCH溶液18 h的浸泡對斑馬魚的抗氧化酶活性無影響，但加長浸泡時間為24 h后，其抗氧化酶活性均被顯著誘導(dǎo)升高。250 mg/L組SOD活性在浸泡18 h后第1天沒有被顯著影響，而在浸泡24 h后，SOD活性在第1天時被顯著抑制，在第3天時又被誘導(dǎo)升高；CAT活性在第6天出現(xiàn)極顯著升高后，第9天又出現(xiàn)極顯著抑制的情況，在第15天時又均恢復(fù)至正常水平，且各濃度下延長浸泡時間可使SOD和GSH-Px活性的誘導(dǎo)提前。分析可能由于高濃度及長時間的浸泡刺激使魚體內(nèi)其他抗氧化酶或抗氧化系統(tǒng)被激活，平衡了體內(nèi)過多的氧自由基，從而解除了SOD活性的抑制，使其又恢復(fù)到被誘導(dǎo)的狀態(tài)。

綜上，斑馬魚對TCH的敏感性高且標(biāo)記效果顯著，其中150 mg/L和250 mg/L濃度TCH溶液浸泡18 h標(biāo)記斑馬魚的效果最佳，且沒有對魚體產(chǎn)生氧化損傷。綜合考慮TCH適合作為一種性價比較高的熒光染料應(yīng)用于增殖放流魚苗的大規(guī)模標(biāo)記工作。