肖 煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，李芳遠(yuǎn)，佟延南，王德強(qiáng)，楊 弘

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水魚類遺傳育種和養(yǎng)殖生物學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214081；2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，?？?570100)

養(yǎng)殖密度是影響魚類生長(zhǎng)速度、養(yǎng)殖產(chǎn)量和效益的主要因素之一。近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖集約化水平的提高，魚類等水產(chǎn)動(dòng)物放養(yǎng)密度不斷上升，單位水體的生產(chǎn)量顯著提升，經(jīng)濟(jì)效益增加明顯[1]。然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖密度的上升會(huì)引起魚類對(duì)資源的競(jìng)爭(zhēng)加劇，魚類生理水平發(fā)生變化，因此過高的養(yǎng)殖密度可能導(dǎo)致魚類生長(zhǎng)、代謝及免疫水平的變化，致使魚類用于生長(zhǎng)的能量減少，對(duì)生產(chǎn)效益產(chǎn)生影響[2，3]。此外，過高的養(yǎng)殖密度也會(huì)給養(yǎng)殖水環(huán)境帶來一定的破壞[4]，因此尋找魚類合適的養(yǎng)殖密度是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的重要方向。

吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，具有生長(zhǎng)快、食性雜、無(wú)肌間刺等諸多優(yōu)點(diǎn)，深受各國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者的歡迎，也是我國(guó)的主要養(yǎng)殖魚類之一。然而隨著人工成本 、飼料價(jià)格、池塘租金的逐步上升，羅非魚養(yǎng)殖成本逐年增加，而商品魚受市場(chǎng)各類因素影響，價(jià)格持續(xù)下跌，羅非魚養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益逐年下降。羅非魚混養(yǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的南美白對(duì)蝦的模式，可以提高羅非魚餌料利用率，降低池塘內(nèi)代謝物積累，而且羅非魚可以攝食病蝦，有效減少對(duì)蝦病害發(fā)生率，提高養(yǎng)殖效益[5]。目前，該混養(yǎng)模式下的羅非魚最適養(yǎng)殖密度研究還存在空缺，因此有必要對(duì)現(xiàn)有的魚蝦混養(yǎng)模式進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提升養(yǎng)殖效益并促進(jìn)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。本研究對(duì)以羅非魚為主養(yǎng)對(duì)象的魚蝦混養(yǎng)模式下不同放養(yǎng)密度羅非魚的生長(zhǎng)、代謝和非特異性免疫指標(biāo)開展跟蹤分析，旨在確定該模式下羅非魚的最佳養(yǎng)殖密度，為以羅非魚作為主養(yǎng)對(duì)象的魚蝦混養(yǎng)模式提供生產(chǎn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖

試驗(yàn)在?？谌瓰仇B(yǎng)殖基地開展，試驗(yàn)池塘為堤鋪地膜的對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘，共3口，每口池塘面積3 335 m2，塘深2.0 m，水深1.5 m，塘底有少量淤泥，進(jìn)排水系統(tǒng)完全，從三江灣入?？谌∷闯渑?，水體鹽度0.5%，每口池塘配置1臺(tái)3.0 kW的羅茨增氧機(jī)，底部微孔增氧，保持溶解氧在6.0 mg/L以上。5月底分別放養(yǎng)吉富羅非魚苗(0.65 g/尾)和凡納濱對(duì)蝦苗(2.5～3.0 cm)，3口池塘羅非魚放養(yǎng)密度分別為6 000、8 000、10 000尾/667 m2；對(duì)蝦苗養(yǎng)殖采用輪捕輪放的方式，每次每口池塘投放5 000尾，共投放3次。試驗(yàn)期間按投放羅非魚的尾數(shù)投喂同等質(zhì)量的羅非魚飼料，分別在8∶00～9∶00和17∶00～18∶00利用投餌機(jī)進(jìn)行飼料投喂，飼料投喂量和投喂頻率視羅非魚生長(zhǎng)情況、天氣、魚類活動(dòng)情況進(jìn)行調(diào)整。定期潑灑益生菌改善水質(zhì)， pH維持在8.0～8.5。

1.2 樣品采集及測(cè)量

經(jīng)過150 d養(yǎng)殖后，停止投喂24 h，各池塘隨機(jī)捕撈羅非魚100尾，投入100 mg/L的MS-222 中進(jìn)行麻醉，分別用電子天平和直尺測(cè)量體重(BW)和體長(zhǎng)(BL)，每個(gè)池塘隨機(jī)選取15 尾魚，尾靜脈采血，4 ℃下5 000g/min離心5 min，吸取上層血清，使用邁瑞B(yǎng)S-600 全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行分析測(cè)定甘油三脂(TG) 、總膽固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT) 、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST) 、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)等生理生化指標(biāo)。同時(shí)，每口池取9尾魚，解剖并取50 mg左右肝臟凍存于液氮中，用于免疫相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)。

按以下公式計(jì)算增重率(WGR)、特定生長(zhǎng)率(SGR)和肥滿度(CF) 。

增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

特定生長(zhǎng)率(SGR)= (lnWt-lnW0)/t×100%

肥滿度(CF)=100×Wt/L3

其中W0為初始魚體重(g)，Wt為實(shí)驗(yàn)?zāi)~體重(g)，Lt為實(shí)驗(yàn)?zāi)~體長(zhǎng)(cm)，t為養(yǎng)殖天數(shù)。

1.3 cDNA的合成與Real-time PCR

肝臟樣品在液氮中研磨后，用Trizol法提取總RNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，并用NanoDrop Lite (Thermo Scientific， USA)分別測(cè)定樣品總RNA濃度和質(zhì)量。取1 μg 肝臟RNA使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)將mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)候選基因C型溶菌酶C-LZM、腫瘤壞死因子TNF-α、細(xì)胞白介素IL-1β的引物，所有基因的引物序列見表1。引物序列均由上海生工生物科技有限公司合成。以cDNA為模板，在ABI 7900 HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI， USA)中進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL: SYBRGreen Realtime PCR Master Mix(Toyobo)10 μL，目的基因上下游引物各1.6 μL，cDNA模板 1 μL，RNase Free Water 5.8 μL，單樣品重復(fù)3 次。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min 20 s；95 ℃ 15 s、59～61 ℃ 60 s，循環(huán)數(shù)為40。

表1 免疫基因的引物序列及其退火溫度Tab.1 Immune functional gene primers sequences and annealing temperature

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)。所有數(shù)據(jù)分析結(jié)果使用 SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)， 當(dāng)結(jié)果達(dá)到顯著差異(P<0.05)時(shí)，采用Tukey’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響

經(jīng)過150 d養(yǎng)殖后羅非魚增重率(WG)分別為71 194%、69 285%和49 977%，特定生長(zhǎng)率(SGR)分別為4.37%/d、4.36%/d和4.14%/d。池塘的養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚生長(zhǎng)有顯著性影響，10 000尾/667 m2密度下羅非魚增重率和特定生長(zhǎng)速率顯著低于6 000尾/667 m2和8 000尾/667 m2密度下養(yǎng)殖的羅非魚，此外6 000尾/667 m2密度下的羅非魚增重率和特定生長(zhǎng)速率略高于8 000尾/667 m2密度下的羅非魚，但兩者差異不顯著。3個(gè)不同養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚肥滿度(CF)無(wú)顯著影響。此外，三個(gè)密度下分別收獲(10～12.5 g)規(guī)格的對(duì)蝦165、159、151 kg，對(duì)蝦產(chǎn)量隨著羅非魚養(yǎng)殖密度的上升呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。

表2 不同養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚生長(zhǎng)性能的影響Tab.2 Growth performance of tilapia reared at different stocking densities

2.2 養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚代謝和免疫的影響

血清葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇等代謝指標(biāo)受養(yǎng)殖密度影響顯著，其中10 000尾/667 m2密度下羅非魚血清中葡萄糖、甘油三脂和總膽固醇濃度均低于6 000尾/667 m2和8 000尾/667 m2密度下養(yǎng)殖的羅非魚；而谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，10 000尾/667 m2密度下羅非魚血清中兩者的含量顯著高于養(yǎng)殖密度為6 000和8 000尾/667 m2池塘的羅非魚。血清中堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶在3個(gè)養(yǎng)殖密度的羅非魚體中無(wú)顯著性差異。

表3 不同養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚血清代謝及免疫指標(biāo)的影響Tab.3 The levels of serum metabolism and immune parameters of tilapia reared at different stocking densities

由圖1可知，不同養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚的免疫相關(guān)基因表達(dá)有顯著性影響，其中C-LZM隨著養(yǎng)殖密度的上升 顯著性下降，10 000尾/667 m2密度下羅非魚肝臟的C-LZM表達(dá)量顯著低于養(yǎng)殖密度為6 000 m2和8 000 尾/667 m2池塘的羅非魚。而IL-1β、TNF-α則與之相反，IL-1β方面，6 000 尾/667 m2密度下羅非魚肝臟表達(dá)水平顯著低于8 000和10 000 尾/667 m2養(yǎng)殖密度；TNF-α方面，6 000和8 000尾/667 m2密度下羅非魚肝臟表達(dá)水平顯著低于10 000 尾/667 m2。

圖1 不同養(yǎng)殖密度對(duì)羅非魚肝臟相關(guān)免疫基因的表達(dá)水平Fig.1 Hepatic immune functional gene transcripts of tilapia reared at different stocking densities

3 討論

養(yǎng)殖密度是影響水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)力和養(yǎng)殖效益的重要因素，而魚類生長(zhǎng)性能是評(píng)價(jià)養(yǎng)殖密度優(yōu)劣的重要指標(biāo)[6，7]。目前對(duì)羅非魚在傳統(tǒng)的粗放的養(yǎng)殖管理模式下的最佳養(yǎng)殖密度在1 500～2 500 尾/667 m2之間[8]。而隨著現(xiàn)代化養(yǎng)殖設(shè)施的應(yīng)用，我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖技術(shù)和管理水平不斷獲得提高，羅非魚集約化養(yǎng)殖可以突破5 000 尾/667 m2以上的密度。然而由于水體的容量關(guān)系該模式下羅非魚合理養(yǎng)殖密度有一定的上限，不合理的提升養(yǎng)殖密度容易造成擁擠脅迫，進(jìn)而降低餌料系數(shù)和生長(zhǎng)速率[9，10]；同時(shí)，高密度更易導(dǎo)致魚類排泄物積累，致使導(dǎo)致養(yǎng)殖水體中氨氮、溶解氧、浮游生物等理化和生物因素產(chǎn)生劇烈變化，對(duì)羅非魚代謝、免疫水平帶來負(fù)面影響[11]。因此，特定養(yǎng)殖條件和管理?xiàng)l件，均有相對(duì)應(yīng)的適宜養(yǎng)殖密度。研究結(jié)果顯示密度為6 000、8 000 尾/667 m2羅非魚生長(zhǎng)速率差異不顯著，而10 000 尾/667 m2的密度下羅非魚生長(zhǎng)速率顯著低于6 000和8 000 尾/667 m2，過低的養(yǎng)殖密度易導(dǎo)致養(yǎng)殖效益下降，該養(yǎng)殖模式下養(yǎng)殖密度上限保持在8 000 尾/667 m2較為合適。

血液作為魚類重要的組織之一，其生理指標(biāo)變化與機(jī)體的新陳代謝、生理狀況有密切關(guān)系，因而可用來評(píng)價(jià)魚體的健康狀況及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)[12，13]。強(qiáng)俊等[14]在室內(nèi)對(duì)吉富羅非魚急性脅迫實(shí)驗(yàn)顯示隨著擁擠脅迫時(shí)間的增加，羅非魚血清GLU和TG水平呈逐漸下降的趨勢(shì)。在本研究中，養(yǎng)殖羅非魚的血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)均受到養(yǎng)殖密度的影響，隨著養(yǎng)殖密度的上升而逐漸下降，這可能歸因于羅非魚在較高密度下的長(zhǎng)期脅迫下，維持羅非魚的健康生長(zhǎng)需要更多的能量消耗，GLU作為第一類供能物質(zhì)，必然處于較低的水平，同時(shí)GLU一旦消耗過大必然調(diào)動(dòng)TG和TC類物質(zhì)開展分解代謝，維持血清中的GLU濃度在合理水平。血清中ALT和AST作為魚類氨基酸代謝的重要標(biāo)記酶，在生物體內(nèi)催化α-氨基酸的α-氨基與α-酮基進(jìn)行轉(zhuǎn)換，其活性變化可指示魚類受到脅迫或肝臟應(yīng)激反應(yīng)等[15，16]。本研究中羅非魚在10 000 尾/667 m2密度養(yǎng)殖下ALT和AST的活性均顯著高于6 000和8 000 尾/667 m2密度，說明10 000 尾/667 m2高密度養(yǎng)殖下羅非魚體內(nèi)的氨基酸代謝處于偏離正常水平的應(yīng)激狀態(tài)，通過更多地降解氨基酸來應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，導(dǎo)致ALT和AST的活性上升。

本研究中10 000 尾/667 m2密度下養(yǎng)殖羅非魚肝臟的C-LZM表達(dá)量顯著低于養(yǎng)殖密度為6 000～8 000 尾/667 m2的羅非魚，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期擁擠脅迫下羅非魚肝臟免疫機(jī)能受損，導(dǎo)致C-LZM基因表達(dá)顯著性下降。而C-LZM是一種參與細(xì)胞抵御外界病害侵襲的免疫蛋白，能夠抑制體內(nèi)細(xì)菌繁殖，在機(jī)體防御過程中起著關(guān)鍵作用[17-19]。同時(shí)，腫瘤壞死因子TNF-α和細(xì)胞白介素IL-1β屬于促炎性細(xì)胞因子，在炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)中，TNF-α通常與下游IL-1β基因表達(dá)上調(diào)[20]。研究發(fā)現(xiàn)10 000 尾/667 m2密度下養(yǎng)殖羅非魚肝臟IL-1β和TNF-α表達(dá)量顯著高于6 000 尾/667 m2，這可能是因?yàn)檫^高的養(yǎng)殖密度促進(jìn)體內(nèi)IL-1β和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，促使羅非魚長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖下草魚[21]、塞內(nèi)加爾舌鰨[22]等也出現(xiàn)類似的免疫應(yīng)激變化，與本研究結(jié)果相互驗(yàn)證。

綜合以上，在當(dāng)前混養(yǎng)模式下建議羅非魚養(yǎng)殖密度不高于8 000 尾/667 m2。