徐 進，魏開金，盧建超

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223；2.華中農業(yè)大學水產學院，武漢 430070)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱“小龍蝦”，是目前中國最重要的淡水養(yǎng)殖蝦類。據統(tǒng)計，2017年全國小龍蝦養(yǎng)殖面積達8×103hm2，總產量近113萬 t，全社會經濟總產值約2 685億元，比2016年增長83.15%[1]。急劇增長的養(yǎng)殖規(guī)模背后，隨之而來的是日益嚴重的病害問題[2]。特別是在高溫季節(jié)，病害問題尤為突出。前期研究顯示[3]，30 ℃和35 ℃的高溫能引起克氏原螯蝦機體發(fā)生應激反應，并激活機體的抗氧化系統(tǒng)以降低應激造成的氧化損傷。本實驗進一步探討了高溫應激對克氏原螯蝦非特異性免疫酶活性的影響，并定量檢測了高溫應激下白斑綜合征病毒(WSSV)在體內的增殖活力以評價高溫應激對機體抗WSSV感染的影響，以期為預防克氏原螯蝦白斑綜合征提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗克氏原螯蝦及病毒

試驗用健康克氏原螯蝦為捕自武漢市梁子湖的野生克氏原螯蝦，經過巢式PCR檢測[4，5]確定未感染WSSV病毒。試驗前于25 ℃暫養(yǎng)1周，挑選活力強、無病無傷、規(guī)格基本一致(體重(30±5) g)的克氏原螯蝦用于試驗。養(yǎng)殖用水為曝氣3 d以上的自來水，每日換水一次，暫養(yǎng)期間按蝦體重的5%左右投喂商品蝦料。人工感染用的病毒懸液為實驗室保存的WSSV陽性樣本所制備，使用實時熒光定量PCR技術測定其濃度，-80 ℃保存待用。

1.2 高溫應激對血淋巴液中免疫酶類的影響

取上述規(guī)格基本一致的健康克氏原螯蝦，分別由25 ℃直接放入30 ℃和35 ℃的控溫水箱中進行高溫應激試驗。每個溫度設置1組平行組，每組50尾克氏原螯蝦，控溫水箱的規(guī)格為70 cm×50 cm×40 cm，高溫應激實驗持續(xù)48 h，實驗期間持續(xù)充氧，并減少人為干擾，避免額外應激。

每組分別于應激前(0 h)以及應激后3、6、12、24、48 h等時間節(jié)點各取3尾蝦，將蝦迅速撈起并于圍心腔抽取0.5 mL血淋巴液。血淋巴液用同等體積的5%肝素鈉抗凝，并隨后于4 ℃、3 000g離心10 min，留取上清于-80 ℃保存待測。血淋巴液中的總超氧化物歧化酶(T-SOD)、多酚氧化酶(PPO)、溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)均采用檢測試劑盒測定，試劑盒為南京建成生物工程研究所產品，堿性磷酸酶(ALP)用希森美康全自動生化分析儀(chemix-800)測定。

1.3 高溫應激對WSSV在體內復制的影響

人工感染實驗分為3個感染實驗組，即35、30和25 ℃組，每組50尾，25 ℃暫養(yǎng)一周后進行人工感染實驗。實驗前將各組的水溫升至相應的溫度并持續(xù)充氧，保證溶氧不低于5 mg/L。實驗蝦于腹部肌肉處每尾注射50 μL病毒懸液(含109病毒拷貝)，同時放入相應的試驗組內進行飼養(yǎng)，實驗期間不投食，不換水。每個實驗組分別于感染后3、6、12、24、48、72 h隨機取3尾蝦，采集鰓組織進行病毒定量檢測。WSSV的實時熒光定量PCR檢測方法參照文獻[6]進行。

1.4 高溫應激下人工感染的累積死亡率測定

人工感染實驗同上，每個實驗組同時設置陰性對照，陰性對照組每尾注射50 μL PBS。持續(xù)觀察記錄克氏原螯蝦發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計累積死亡率。

1.5 數(shù)據統(tǒng)計與分析

數(shù)據用SPSS 12.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和DUNCAN多重比較，所有結果均以平均值±標準差來表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 高溫應激對克氏原螯蝦血淋巴免疫酶類的影響

在30 ℃和35 ℃的高溫應激下，隨著時間的延長，克氏原螯蝦血淋巴液中的T-SOD、PPO、LYZ、ACP和ALP均有不同程度的變化(見表1，圖1)。

在30 ℃溫度下，克氏原螯蝦血淋巴液中的T-SOD在應激后3 h出現(xiàn)上升并維持至12 h，隨后開始降低，24 h降低至應激前水平，且繼續(xù)降低48 h后與應激前差異顯著。35 ℃下，T-SOD也在3 h后出現(xiàn)上升，其含量比30 ℃組略高，3 h后出現(xiàn)下降，48 h T-SOD含量比應激前水平略低，但差異不顯著。30 ℃溫度應激下，PPO的含量在應激后24 h內變化不明顯，之后略微升高；35 ℃應激下，PPO含量在0～6 h內略微升高(差異不顯著)，之后顯著下降，至24 h達到最低點，較應激前差異顯著。LYZ含量在30 ℃和35 ℃高溫應激后都出現(xiàn)顯著下降，24 h后下降速度變緩，35 ℃組比30 ℃組含量更低。35 ℃溫度應激后ACP的含量變化不明顯。30 ℃應激后ACP含量顯著下降，3 h后變化不明顯。ALP含量在35 ℃和30 ℃高溫應激后先出現(xiàn)下降，3 h(30 ℃)和6 h(35 ℃)后出現(xiàn)回升，但與應激前水平相比變化不顯著?？傮w上看，T-SOD與LYZ含量在高溫應激后都出現(xiàn)了顯著性降低，PPO、ACP和ALP的變化差異不大。

表1 高溫應激對克氏原螯蝦血淋巴免疫酶類的影響Tab.1 Effects of high temperature stresses on the immune parameters in the hemolymph of P. clarkii

圖1 高溫應激后克氏原螯蝦血淋巴免疫酶類的變化Fig.1 Varieties of the immune-related enzymes in hemolymph of P. clarkia post high temperature stress

2.2 高溫應激下WSSV在克氏原螯蝦體內增殖活力

測定了在25、30和35 ℃下WSSV在克氏原螯蝦體內的增殖活力。結果顯示(如圖2)，在35 ℃下，病毒增殖趨勢不明顯；在30 ℃下，病毒增殖活躍，感染后3 h變化不明顯，但在6至24 h出現(xiàn)顯著增長，單位組織中的病毒含量增加1 000多倍，隨后增長趨勢趨緩；同樣在25 ℃下，病毒增殖活躍，感染后3 h單位組織中的病毒含量比30 ℃組的略高，但之后一直低于30 ℃組。綜上所述，在35 ℃飼養(yǎng)條件下，WSSV在克氏原螯蝦體內的增殖受到抑制，但在30 ℃飼養(yǎng)條件下，WSSV在克氏原螯蝦體內的增殖較常溫(25 ℃)下更活躍。

圖2 克氏原螯蝦在高溫應激下感染WSSV后鰓組織中的病毒載量Fig.2 Viral load in gill tissue of P. clarkia post WSSV infection under high temperature stress

2.3 高溫應激下克氏原螯蝦對WSSV的抵抗力

測定了克氏原螯蝦在25、30和35 ℃下人工感染WSSV的累積死亡率，以評估高溫應激下克氏原螯蝦對WSSV的抵抗力。結果顯示(圖3)，25 ℃感染組在感染2 d后累積死亡率劇增，感染3 d后累積死亡率達到90%，感染4 d后全部死亡。30 ℃感染組在感染1 d后累積死亡率劇增，3 d后全部死亡。35 ℃感染組的累積死亡率增加緩慢，感染4 d后死亡率達到20%，5 d后40%，之后沒有出現(xiàn)更多死亡。25 ℃陰性對照組未出現(xiàn)發(fā)病死亡情況。可見，25 ℃感染組和30 ℃感染組的累積死亡率很高，但30 ℃感染組發(fā)病更快，病程更短。

圖3 克氏原螯蝦在高溫應激下感染WSSV后的累積死亡率Fig.3 Cumulative mortality of WSSV infection of P. clarkia under high temperature stress

3 討論

應激是生物適應性的一種表現(xiàn)形式，但過度的應激往往會引發(fā)機體正常生理功能的紊亂，導致各種疾病或亞疾病狀況的出現(xiàn)[7]。前期研究結果顯示，30 ℃和35 ℃高溫能使克氏原螯蝦機體產生應激反應，組織中的丙二醛(MDA)含量迅速升高，至24 h后達到最高值[3]。MDA是細胞脂質過氧化的產物，具有很強生物毒性，它可損傷生物膜結構，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應的正常進行[8]。本研究探討了高溫應激對克氏原螯蝦機體免疫機能的影響。結果顯示，在高溫應激下，克氏原螯蝦血淋巴中的T-SOD與LYZ含量在高溫應激后都出現(xiàn)了顯著性降低。T-SOD是生物體內具有抗氧化功能的酶，是活性氧自由基的天然消除劑?；钚匝踝杂苫?Reactive Oxygen Species，ROS)是吞噬細胞吞噬病原等異物后引發(fā)呼吸爆發(fā)而產生的超氧陰離子(O2-)、H2O2、OH-及其衍生物等，它具有很強的氧化活性，能攻擊周圍幾乎所有的生物分子，引起蛋白變性、脂類過氧化、DNA突變和酶失活等[9]。有研究表明，免疫細胞對氧化應激非常敏感，因為免疫細胞細胞膜含有高濃度、對過氧化反應高度敏感的不飽和脂肪酸，因此免疫細胞容易受到過量ROS的損傷，進而影響免疫系統(tǒng)功能[10]。因此，過多的ROS若不能及時清除，最終可導致機體的抗病能力下降甚至死亡[11]。高溫應激導致克氏原螯蝦T-SOD顯著下降，必然導致機體的抗氧化能力減弱，使ROS和MDA無法及時清除，對機體的免疫機能產生負面影響。LYZ是一種能水解致病菌中粘多糖的堿性酶，它使細胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂內容物逸出而使細菌溶解。LYZ作為非特異性免疫因子，在蝦類抗病原微生物感染中具有重要作用[12]。高溫應激導致克氏原螯蝦血淋巴中LYZ的活性降低，直接導致了其對病原微生物的抵抗力降低。

WSSV是目前危害蝦類和蟹類的主要病毒病原[13]，也是克氏原螯蝦養(yǎng)殖中危害最大的病毒病原，流行病學資料顯示，克氏原螯蝦白斑綜合征的發(fā)病季節(jié)一般在3月底至7月[14]，其中5月份是發(fā)病高峰期[15]。溫度通常能對病毒的復制產生較大影響。Du等[16]研究了高溫對WSSV在克氏原螯蝦體內復制的影響，其結果顯示，克氏原螯蝦在(32±1) ℃時未見蝦死亡，但轉至(24±1) ℃時死亡率達到了100%，組織中的病毒載量從105copies/mg10[14]，表明在(32±1) ℃時WSSV增殖亦受到抑制。這與本研究的結果基本一致，WSSV在35 ℃時，的確組織中的病毒載量顯著低于25 ℃和30 ℃組，感染后72 h的數(shù)據顯示，35 ℃組的病毒載量是25 ℃和30 ℃組的1/1 000左右。30 ℃組和25 ℃組在感染WSSV后組織中的病毒載量持續(xù)增加，在感染后3 h，30 ℃組的病毒載量比25 ℃組略低，之后一直高于25 ℃組。推測可能是由于高溫應激對免疫系統(tǒng)的脅迫效應導致30 ℃組的病毒增殖更加活躍。而在35 ℃時，溫度對病毒增殖的抑制作用更大，盡管免疫系統(tǒng)也受到脅迫，但病毒的復制效率卻不高，導致組織中的病毒載量變化不大。病毒增殖活力同樣反映在發(fā)病進程和累積死亡率上，35 ℃組的發(fā)病進程慢且累積死亡率只有35%，而30 ℃組和25 ℃組的發(fā)病進程快，分別在感染后的第3天和4天累積死亡率達到100%?？梢姡邷貞さ拿{迫效應雖然導致了克氏原螯蝦免疫力下降，但同時由于WSSV在35 ℃時復制受到抑制而出現(xiàn)發(fā)病率和死亡率降低的情況。這一結論也印證了WSSV的流行病學特征，即在5、6月份時WSSV廣泛暴發(fā)，而在8月水溫最高時卻發(fā)病較少。

在克氏原螯蝦養(yǎng)殖過程中，每年的高溫季節(jié)無法回避，高溫應激導致的免疫脅迫效應必然導致克氏原螯蝦對病原的抵抗力降低，使其更容易發(fā)病。雖然本實驗揭示了在30 ℃和35 ℃下WSSV對克氏原螯蝦的致死率有差異，但此規(guī)律對于其他病原，特別是細菌病原，并不適用。因此，在疾病高發(fā)季節(jié)，還是應該采取一切必要手段來降低和緩解高溫造成的脅迫效應，來降低疾病的發(fā)生風險。