徐 進，魏開金，盧建超

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱“小龍蝦”，是目前中國最重要的淡水養(yǎng)殖蝦類。據(jù)統(tǒng)計，2017年全國小龍蝦養(yǎng)殖面積達8×103hm2，總產(chǎn)量近113萬 t，全社會經(jīng)濟總產(chǎn)值約2 685億元，比2016年增長83.15%[1]。急劇增長的養(yǎng)殖規(guī)模背后，隨之而來的是日益嚴(yán)重的病害問題[2]。特別是在高溫季節(jié)，病害問題尤為突出。前期研究顯示[3]，30 ℃和35 ℃的高溫能引起克氏原螯蝦機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，并激活機體的抗氧化系統(tǒng)以降低應(yīng)激造成的氧化損傷。本實驗進一步探討了高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦非特異性免疫酶活性的影響，并定量檢測了高溫應(yīng)激下白斑綜合征病毒(WSSV)在體內(nèi)的增殖活力以評價高溫應(yīng)激對機體抗WSSV感染的影響，以期為預(yù)防克氏原螯蝦白斑綜合征提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗克氏原螯蝦及病毒

試驗用健康克氏原螯蝦為捕自武漢市梁子湖的野生克氏原螯蝦，經(jīng)過巢式PCR檢測[4，5]確定未感染W(wǎng)SSV病毒。試驗前于25 ℃暫養(yǎng)1周，挑選活力強、無病無傷、規(guī)格基本一致(體重(30±5) g)的克氏原螯蝦用于試驗。養(yǎng)殖用水為曝氣3 d以上的自來水，每日換水一次，暫養(yǎng)期間按蝦體重的5%左右投喂商品蝦料。人工感染用的病毒懸液為實驗室保存的WSSV陽性樣本所制備，使用實時熒光定量PCR技術(shù)測定其濃度，-80 ℃保存待用。

1.2 高溫應(yīng)激對血淋巴液中免疫酶類的影響

取上述規(guī)格基本一致的健康克氏原螯蝦，分別由25 ℃直接放入30 ℃和35 ℃的控溫水箱中進行高溫應(yīng)激試驗。每個溫度設(shè)置1組平行組，每組50尾克氏原螯蝦，控溫水箱的規(guī)格為70 cm×50 cm×40 cm，高溫應(yīng)激實驗持續(xù)48 h，實驗期間持續(xù)充氧，并減少人為干擾，避免額外應(yīng)激。

每組分別于應(yīng)激前(0 h)以及應(yīng)激后3、6、12、24、48 h等時間節(jié)點各取3尾蝦，將蝦迅速撈起并于圍心腔抽取0.5 mL血淋巴液。血淋巴液用同等體積的5%肝素鈉抗凝，并隨后于4 ℃、3 000g離心10 min，留取上清于-80 ℃保存待測。血淋巴液中的總超氧化物歧化酶(T-SOD)、多酚氧化酶(PPO)、溶菌酶(LYZ)、酸性磷酸酶(ACP)均采用檢測試劑盒測定，試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，堿性磷酸酶(ALP)用希森美康全自動生化分析儀(chemix-800)測定。

1.3 高溫應(yīng)激對WSSV在體內(nèi)復(fù)制的影響

人工感染實驗分為3個感染實驗組，即35、30和25 ℃組，每組50尾，25 ℃暫養(yǎng)一周后進行人工感染實驗。實驗前將各組的水溫升至相應(yīng)的溫度并持續(xù)充氧，保證溶氧不低于5 mg/L。實驗蝦于腹部肌肉處每尾注射50 μL病毒懸液(含109病毒拷貝)，同時放入相應(yīng)的試驗組內(nèi)進行飼養(yǎng)，實驗期間不投食，不換水。每個實驗組分別于感染后3、6、12、24、48、72 h隨機取3尾蝦，采集鰓組織進行病毒定量檢測。WSSV的實時熒光定量PCR檢測方法參照文獻[6]進行。

1.4 高溫應(yīng)激下人工感染的累積死亡率測定

人工感染實驗同上，每個實驗組同時設(shè)置陰性對照，陰性對照組每尾注射50 μL PBS。持續(xù)觀察記錄克氏原螯蝦發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計累積死亡率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用SPSS 12.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和DUNCAN多重比較，所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦血淋巴免疫酶類的影響

在30 ℃和35 ℃的高溫應(yīng)激下，隨著時間的延長，克氏原螯蝦血淋巴液中的T-SOD、PPO、LYZ、ACP和ALP均有不同程度的變化(見表1，圖1)。

在30 ℃溫度下，克氏原螯蝦血淋巴液中的T-SOD在應(yīng)激后3 h出現(xiàn)上升并維持至12 h，隨后開始降低，24 h降低至應(yīng)激前水平，且繼續(xù)降低48 h后與應(yīng)激前差異顯著。35 ℃下，T-SOD也在3 h后出現(xiàn)上升，其含量比30 ℃組略高，3 h后出現(xiàn)下降，48 h T-SOD含量比應(yīng)激前水平略低，但差異不顯著。30 ℃溫度應(yīng)激下，PPO的含量在應(yīng)激后24 h內(nèi)變化不明顯，之后略微升高；35 ℃應(yīng)激下，PPO含量在0～6 h內(nèi)略微升高(差異不顯著)，之后顯著下降，至24 h達到最低點，較應(yīng)激前差異顯著。LYZ含量在30 ℃和35 ℃高溫應(yīng)激后都出現(xiàn)顯著下降，24 h后下降速度變緩，35 ℃組比30 ℃組含量更低。35 ℃溫度應(yīng)激后ACP的含量變化不明顯。30 ℃應(yīng)激后ACP含量顯著下降，3 h后變化不明顯。ALP含量在35 ℃和30 ℃高溫應(yīng)激后先出現(xiàn)下降，3 h(30 ℃)和6 h(35 ℃)后出現(xiàn)回升，但與應(yīng)激前水平相比變化不顯著?？傮w上看，T-SOD與LYZ含量在高溫應(yīng)激后都出現(xiàn)了顯著性降低，PPO、ACP和ALP的變化差異不大。

表1 高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦血淋巴免疫酶類的影響Tab.1 Effects of high temperature stresses on the immune parameters in the hemolymph of P. clarkii

圖1 高溫應(yīng)激后克氏原螯蝦血淋巴免疫酶類的變化Fig.1 Varieties of the immune-related enzymes in hemolymph of P. clarkia post high temperature stress

2.2 高溫應(yīng)激下WSSV在克氏原螯蝦體內(nèi)增殖活力

測定了在25、30和35 ℃下WSSV在克氏原螯蝦體內(nèi)的增殖活力。結(jié)果顯示(如圖2)，在35 ℃下，病毒增殖趨勢不明顯；在30 ℃下，病毒增殖活躍，感染后3 h變化不明顯，但在6至24 h出現(xiàn)顯著增長，單位組織中的病毒含量增加1 000多倍，隨后增長趨勢趨緩；同樣在25 ℃下，病毒增殖活躍，感染后3 h單位組織中的病毒含量比30 ℃組的略高，但之后一直低于30 ℃組。綜上所述，在35 ℃飼養(yǎng)條件下，WSSV在克氏原螯蝦體內(nèi)的增殖受到抑制，但在30 ℃飼養(yǎng)條件下，WSSV在克氏原螯蝦體內(nèi)的增殖較常溫(25 ℃)下更活躍。

圖2 克氏原螯蝦在高溫應(yīng)激下感染W(wǎng)SSV后鰓組織中的病毒載量Fig.2 Viral load in gill tissue of P. clarkia post WSSV infection under high temperature stress

2.3 高溫應(yīng)激下克氏原螯蝦對WSSV的抵抗力

測定了克氏原螯蝦在25、30和35 ℃下人工感染W(wǎng)SSV的累積死亡率，以評估高溫應(yīng)激下克氏原螯蝦對WSSV的抵抗力。結(jié)果顯示(圖3)，25 ℃感染組在感染2 d后累積死亡率劇增，感染3 d后累積死亡率達到90%，感染4 d后全部死亡。30 ℃感染組在感染1 d后累積死亡率劇增，3 d后全部死亡。35 ℃感染組的累積死亡率增加緩慢，感染4 d后死亡率達到20%，5 d后40%，之后沒有出現(xiàn)更多死亡。25 ℃陰性對照組未出現(xiàn)發(fā)病死亡情況?？梢?，25 ℃感染組和30 ℃感染組的累積死亡率很高，但30 ℃感染組發(fā)病更快，病程更短。

圖3 克氏原螯蝦在高溫應(yīng)激下感染W(wǎng)SSV后的累積死亡率Fig.3 Cumulative mortality of WSSV infection of P. clarkia under high temperature stress

3 討論

應(yīng)激是生物適應(yīng)性的一種表現(xiàn)形式，但過度的應(yīng)激往往會引發(fā)機體正常生理功能的紊亂，導(dǎo)致各種疾病或亞疾病狀況的出現(xiàn)[7]。前期研究結(jié)果顯示，30 ℃和35 ℃高溫能使克氏原螯蝦機體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，組織中的丙二醛(MDA)含量迅速升高，至24 h后達到最高值[3]。MDA是細胞脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，具有很強生物毒性，它可損傷生物膜結(jié)構(gòu)，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進行[8]。本研究探討了高溫應(yīng)激對克氏原螯蝦機體免疫機能的影響。結(jié)果顯示，在高溫應(yīng)激下，克氏原螯蝦血淋巴中的T-SOD與LYZ含量在高溫應(yīng)激后都出現(xiàn)了顯著性降低。T-SOD是生物體內(nèi)具有抗氧化功能的酶，是活性氧自由基的天然消除劑。活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)是吞噬細胞吞噬病原等異物后引發(fā)呼吸爆發(fā)而產(chǎn)生的超氧陰離子(O2-)、H2O2、OH-及其衍生物等，它具有很強的氧化活性，能攻擊周圍幾乎所有的生物分子，引起蛋白變性、脂類過氧化、DNA突變和酶失活等[9]。有研究表明，免疫細胞對氧化應(yīng)激非常敏感，因為免疫細胞細胞膜含有高濃度、對過氧化反應(yīng)高度敏感的不飽和脂肪酸，因此免疫細胞容易受到過量ROS的損傷，進而影響免疫系統(tǒng)功能[10]。因此，過多的ROS若不能及時清除，最終可導(dǎo)致機體的抗病能力下降甚至死亡[11]。高溫應(yīng)激導(dǎo)致克氏原螯蝦T-SOD顯著下降，必然導(dǎo)致機體的抗氧化能力減弱，使ROS和MDA無法及時清除，對機體的免疫機能產(chǎn)生負(fù)面影響。LYZ是一種能水解致病菌中粘多糖的堿性酶，它使細胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。LYZ作為非特異性免疫因子，在蝦類抗病原微生物感染中具有重要作用[12]。高溫應(yīng)激導(dǎo)致克氏原螯蝦血淋巴中LYZ的活性降低，直接導(dǎo)致了其對病原微生物的抵抗力降低。

WSSV是目前危害蝦類和蟹類的主要病毒病原[13]，也是克氏原螯蝦養(yǎng)殖中危害最大的病毒病原，流行病學(xué)資料顯示，克氏原螯蝦白斑綜合征的發(fā)病季節(jié)一般在3月底至7月[14]，其中5月份是發(fā)病高峰期[15]。溫度通常能對病毒的復(fù)制產(chǎn)生較大影響。Du等[16]研究了高溫對WSSV在克氏原螯蝦體內(nèi)復(fù)制的影響，其結(jié)果顯示，克氏原螯蝦在(32±1) ℃時未見蝦死亡，但轉(zhuǎn)至(24±1) ℃時死亡率達到了100%，組織中的病毒載量從105copies/mg10[14]，表明在(32±1) ℃時WSSV增殖亦受到抑制。這與本研究的結(jié)果基本一致，WSSV在35 ℃時，的確組織中的病毒載量顯著低于25 ℃和30 ℃組，感染后72 h的數(shù)據(jù)顯示，35 ℃組的病毒載量是25 ℃和30 ℃組的1/1 000左右。30 ℃組和25 ℃組在感染W(wǎng)SSV后組織中的病毒載量持續(xù)增加，在感染后3 h，30 ℃組的病毒載量比25 ℃組略低，之后一直高于25 ℃組。推測可能是由于高溫應(yīng)激對免疫系統(tǒng)的脅迫效應(yīng)導(dǎo)致30 ℃組的病毒增殖更加活躍。而在35 ℃時，溫度對病毒增殖的抑制作用更大，盡管免疫系統(tǒng)也受到脅迫，但病毒的復(fù)制效率卻不高，導(dǎo)致組織中的病毒載量變化不大。病毒增殖活力同樣反映在發(fā)病進程和累積死亡率上，35 ℃組的發(fā)病進程慢且累積死亡率只有35%，而30 ℃組和25 ℃組的發(fā)病進程快，分別在感染后的第3天和4天累積死亡率達到100%?？梢姡邷貞?yīng)激的脅迫效應(yīng)雖然導(dǎo)致了克氏原螯蝦免疫力下降，但同時由于WSSV在35 ℃時復(fù)制受到抑制而出現(xiàn)發(fā)病率和死亡率降低的情況。這一結(jié)論也印證了WSSV的流行病學(xué)特征，即在5、6月份時WSSV廣泛暴發(fā)，而在8月水溫最高時卻發(fā)病較少。

在克氏原螯蝦養(yǎng)殖過程中，每年的高溫季節(jié)無法回避，高溫應(yīng)激導(dǎo)致的免疫脅迫效應(yīng)必然導(dǎo)致克氏原螯蝦對病原的抵抗力降低，使其更容易發(fā)病。雖然本實驗揭示了在30 ℃和35 ℃下WSSV對克氏原螯蝦的致死率有差異，但此規(guī)律對于其他病原，特別是細菌病原，并不適用。因此，在疾病高發(fā)季節(jié)，還是應(yīng)該采取一切必要手段來降低和緩解高溫造成的脅迫效應(yīng)，來降低疾病的發(fā)生風(fēng)險。