楊羽君，鄂秀輝

(天津市天士力控股集團有限公司研究院，天津 300410)

桂枝為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥嫩枝，具有發(fā)汗解肌、溫通經脈、助陽化氣、平沖降氣之功效[1]。自漢代張仲景《傷寒論》以來，為歷代醫(yī)家所常用。據統(tǒng)計，桂枝在經方中的使用頻率僅次于甘草，是常用的解表藥，主要產地為廣東、廣西、云南等省區(qū)[2]。臨床上多用于風寒感冒、脘腹冷痛、血寒經閉、關節(jié)痹痛、痰飲、水腫、心悸、奔豚等病癥[3]。

桂枝中含有的主要成分為桂皮醛(Cin-namaldehyde)和肉桂酸(Cinnamic acid)。藥理研究表明：肉桂酸具有抗菌、消炎作用[4]?！吨袊幍洹?015年版(一部) 桂枝含量測定項下僅對桂皮醛做了相關規(guī)定，未對肉桂酸做出規(guī)定。又由于目前藥材市場的桂枝商品外觀形態(tài)不同，為更加客觀、全面地評價桂枝質量，本文建立了測定桂枝中肉桂酸含量的方法，并分析市售多批桂枝，發(fā)現其外觀形態(tài)與成分含量、價格之間的關系，為不同形態(tài)的桂枝飲片提供質量控制的依據。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜(Waters HPLC e2695-2998，PDA 檢測器)；電子分析天平(XS205，瑞士METTLER TOLEDO 公司)；離心機(ST16R，美國Thermo公司)；超純水系統(tǒng)(Millipore-Q，Millipore公司)；超聲波清洗器(KQ-500DV，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥 肉桂酸對照品(批號110786-200503，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇(色譜純，德國Merck公司)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；超純水(Millipore-Q制備)；冰乙酸(天津市致遠化學試劑有限公司)。12批不同產地的桂枝飲片(批號S1～S12，購于安國藥材市場)，由天士力研究院現代中藥開發(fā)中心人員鑒定為樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥嫩枝炮制而成的飲片。

2 方法與結果

2.1色譜條件 采用Agilent ZORBAX Eclipse C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.1%乙酸水(B)為流動相，梯度洗脫，0～12 min，40%～43% A；12～20 min，43% A；檢測波長：276 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl；理論板數按肉桂酸峰計算應不低于3 000。

2.2溶液制備

2.2.1對照品溶液的制備 取肉桂酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含10 μg的溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取桂枝粉末(過四號篩)約200.0 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25.0 ml，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，4 900 r/min離心10 min，精密量取上清液1.0 ml，置5 ml量瓶中，即得。

2.3系統(tǒng)適用性試驗 取對照品溶液和供試品溶液務10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果肉桂酸色譜峰峰形較好，且與雜質峰較好分離。見圖1。

1.肉桂酸

2.4線性關系的考查 取肉桂酸對照品5.0 至50 ml量瓶中，精密稱定，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液10.0 ml置100 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液A。精密吸取對照品溶液A 3.0 ml于5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液A1；精密吸取對照品溶液A 2.0 ml于5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液A2；精密吸取對照品溶液A 3.0 ml于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液A3；精密吸取對照品溶液1.0 ml于5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液A4；精密吸取對照品溶液A 1.0 ml于10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液A5；精密吸取對照品溶液A 1.0 ml于25 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，即得對照品溶液A6。按照“2.1”項下色譜條件，分別精密吸取對照品A～A6溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度(μg/ ml)為橫坐標(X)繪制標準曲線，得回歸方程：Y= 85 642X+4 440.8(r=0.999 8)，結果表明，肉桂酸在0.40～9.98 μg/ml范圍內線性關系良好。

2.5精密度試驗 取對照品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算肉桂酸峰面積的RSD值為0.39%。結果表明，方法的日內精密度好。

2.6重復性試驗 精密稱取同一批桂枝粉末(過四號篩)200.0 mg 6份。按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算肉桂酸含量的RSD值為0.79%。結果表明，方法重復性好。

2.7穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于配制后第0、1、4、15、18、24和48 h進樣，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算肉桂酸含量的RSD值為0.96%。結果表明，供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性好。

2.8加樣回收率試驗 平行稱取同一批桂枝粉末(過四號篩)100.0 mg 9份，精密稱定，分為高、中、低三個水平，每個水平各3份，分別加入一定量對照品，按照“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算回收率，結果平均回收率為98.18%，RSD為1.13%。見表1。

表1 肉桂酸加樣回收率試驗結果

2.9樣品含量測定 取12批桂枝粉末(過四號篩)每批各2份，每份200.0 mg，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄色譜圖和峰面積，運用外標法計算含量，結果見表2。本試驗測定桂枝12批，肉桂酸含量分布在0.112 2%～0.232 3% 之間。

表2 12批桂枝中肉桂酸含量測定結果(n=2)

3 討論

3.1色譜條件的考查

3.1.1檢測波長的確定 取肉桂酸對照品及供試品分別進行210～400 nm全波長紫外掃描，采用二極管陣列檢測器(PDA)，獲得在不同波長下的數據。檢測到肉桂酸最大吸收波長為276 nm，故選擇276 nm作為肉桂酸的檢測波長。

3.1.2流動相的確定 本試驗先后考查了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%乙酸水和乙腈-1%乙酸水體系，結果顯示肉桂酸在加酸條件下出峰效果更好。乙腈-水體系基線穩(wěn)定，未將色譜峰分離，理論塔板數過低；乙腈-0.1%磷酸水體系基線穩(wěn)定，系統(tǒng)壓力較高；乙腈-1%乙酸水體系基線穩(wěn)定，系統(tǒng)壓力小，但流動相pH過低，長期使用影響色譜柱及儀器；乙腈-0.1%乙酸水體系基線穩(wěn)定，系統(tǒng)壓力小，峰型好。故選擇乙腈-0.1%乙酸水作為流動相，進行梯度洗脫。

3.1.3柱溫的確定 本試驗分別在柱溫25、30和35 ℃進樣，考查色譜參數優(yōu)勢。結果表明，柱溫為30 ℃時對稱因子、理論板數和分離度最優(yōu)，所以柱溫選擇30 ℃，結果見表3。

表3 肉桂酸含量測定中不同柱溫考查結果

3.2提取條件的考查

3.2.1提取時間的確定 取同一批桂枝粉末(過四號篩)200.0 mg 4份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中。分別精密加入甲醇50.0 ml，稱定重量。分別超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)20、30、40和50 min，放冷，再按照“2.2.2”項下方法配制，即得4份供試品溶液。按照“2.1”項下的色譜條件測定。發(fā)現超聲20 min含量明顯偏低，說明提取未完全；超聲40和50 min時含量較超聲30 min含量僅有微量的波動，但在1.5%左右，故判斷為系統(tǒng)誤差。本著操作簡便、節(jié)約等原則確定提取時間為30 min。結果見表4。

表4 不同提取時間考查結果

3.2.2提取溶劑體積的確定 取同一批桂枝粉末(過四號篩)200.0 mg 4份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中。分別精密加入甲醇10.0、25.0、40.0和50.0 ml，稱定重量。分別超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再按照“2.2.2”項下供試品配制方法配制，即得4份供試品溶液。按照“2.1”項下的色譜條件測定。發(fā)現加入10.0 ml溶劑時，色譜峰存在包峰情況；加入40.0和50.0 ml溶劑后測得的含量較加入25.0 ml溶劑測得的含量略有增加，在0.05%左右，故考慮為系統(tǒng)誤差。本著節(jié)約原則確定提取溶劑體積為25.0 ml，結果見表5。

表5 不同提取溶劑體積考查結果

3.3樣品數據分析 本試驗將桂枝飲片根據外觀形態(tài)，如斷面直徑、皮部顏色、木部顏色等方面區(qū)分為三個等級[5]。12批桂枝樣品可以分為以下三個品級：A類(批號S3、S6、S11)，飲片為類圓形或橢圓形的厚片及段，斷面直徑均在3～5 mm之間，皮部呈深紅棕色，木部呈淺黃棕色，髓部明顯略呈方形，特異香氣濃郁；B類(批號S2、S5、S9、S10)，飲片為類圓形或橢圓形的厚片及段，斷面直徑在5～10 mm之間，皮部呈紅棕色，木部呈淺黃棕色，髓部較A類樣品較不明顯，略呈方形或類圓形，有特異香氣；C類(批號S1、S4、S7、S8、S12)，飲片為類圓形或橢圓形的厚片及段，斷面直徑大小不均勻，大部分斷面直徑在10 mm以上，皮部呈棕色，木部呈黃白色，髓部較A類樣品較不明顯，略呈方形或類圓形，有較B類樣品不明顯的特異香氣。如圖2所示，各品級桂枝外觀形態(tài)對比(S11、S2、S8)；如圖3所示，各品級桂枝橫截面對比(S11、S2、S8)。表6列出每批樣品的品級、市售價格及測得肉桂酸的含量信息。

圖2 A、B、C品級桂枝外觀比較

圖3 A、B、C品級桂枝橫截面比較

批次單價(元/kg)品級含量(%)S15C0.125 3S28B0.170 4S311A0.232 3S49C0.116 2S510B0.160 5S612A0.215 8S75C0.112 2S88C0.162 8S98B0.145 0S109B0.172 4S1111A0.191 9S128C0.134 8

根據表中信息，繪制價格-含量關系圖及品級-含量關系圖，如圖4和圖5。由圖4所示，將批號按照市售價格降序排列，折線圖代表各批次桂枝價格的次序，柱狀圖代表每批次桂枝中肉桂酸的含量高低。觀察可知，除少數批次(如S4、S5)外，市售價格與肉桂酸含量基本呈正相關。由圖5可知，按照批號的品級高低進行排列，折線圖代表各批次桂枝價格的高低，柱狀圖代表每批次桂枝中肉桂酸的含量高低。觀察可知，A品級的桂枝明顯較B、C品級的桂枝肉桂酸含量高，且價格較高；B品級的桂枝較A品級桂枝在含量方面有所降低，且價格也較A品級低；C品級的桂枝肉桂酸含量參差不齊，但大部分都較A、B品級的低，價格也相差較大。

圖4 價格-含量關系圖

圖5 品級-含量關系圖

4 結論

中藥的質量優(yōu)劣決定了臨床療效，而且直接關系到人民群眾的生命和健康安全，進而影響著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。由于市場競爭日趨激烈、野生中藥材的資源匱乏、中藥材需求與產量矛盾加劇[6]等原因，導致中藥的質量存在諸多的問題。因此在中藥流通市場中找尋一種能夠通過外觀快速簡便地初步識別藥品質量優(yōu)劣的方法就顯得尤為重要。

本文建立HPLC法對桂枝中肉桂酸的含量進行測定，該方法具有操作簡單、準確度好、靈敏度高等優(yōu)勢，為桂枝提供了質量控制的依據。同時，用該方法對市售12批桂枝藥材進行肉桂酸含量測定，從測試結果看來，藥材市場上流通的桂枝藥材中肉桂酸的含量存在一定差異，且與其外觀形態(tài)、價格具有一定的相關性。通過數據發(fā)現，桂枝飲片的厚片及段的斷面直徑在3～5 mm之間，皮部呈深紅棕色，特異香氣非常濃郁的，肉桂酸的含量較高，也就是將品級評為A級的部分；市售價格與品級基本呈正相關，品級較高即枝條較細的桂枝藥材肉桂酸含量較高，認為是細枝條中皮部占比較高所致，這與文獻報道所述“桂枝皮部肉桂酸含量普遍比木部高”吻合[7]。證明桂枝中肉桂酸含量與桂枝飲片外觀形態(tài)的相關性較好。研究結果表明，能夠通過直觀的觀察法初步判斷桂枝的質量，為市場中初步評價桂枝飲片質量提供便捷有效的方法。