孫 悅，葉冬青，褚 越，張怡飛，劉延琳

（1.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院,寧夏銀川750021；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院,陜西楊凌712100）

葡萄酒的釀造是一個(gè)復(fù)雜的微生物學(xué)過(guò)程，其中由釀酒酵母主導(dǎo)的酒精發(fā)酵是葡萄酒生產(chǎn)中的重要階段之一。釀酒酵母菌株的生物多樣性及群體組成對(duì)葡萄酒的感官質(zhì)量具有重要影響。酵母菌的分類學(xué)方法，從最初的常規(guī)分類學(xué)即以形態(tài)，生理和生化等特征分類，發(fā)展到新的分類技術(shù)，尤其是分子生物學(xué)技術(shù)，近年來(lái)不斷地被應(yīng)用于酵母菌的分類學(xué)研究中。通過(guò)菌株區(qū)分技術(shù)可以揭示釀酒酵母種內(nèi)遺傳多樣性，常規(guī)的遺傳和生理生化手段難以達(dá)到菌株水平的區(qū)分，必須借助于DNA分子標(biāo)記方法來(lái)完成。目前，應(yīng)用于釀酒酵母菌株區(qū)分中最廣泛、最有應(yīng)用前景的技術(shù)有：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記法（RAPD）、線粒體DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（mtDNA-RFLP）、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記法、Interdelta指紋圖譜法以及COX1基因指紋圖譜法等[1]。Interdelta序列之間差異非常豐富，同時(shí)Interdelta序列的數(shù)目和位置在種內(nèi)具有一定的差異性，所以被作為基因標(biāo)記用于區(qū)分釀酒酵母菌株的首選方法。Goodwin等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)Interdelta序列在釀酒酵母基因組中數(shù)量最多，分布最廣，且方法簡(jiǎn)單，操作容易，適用于釀酒酵母菌株的區(qū)分。

在葡萄酒的工業(yè)生產(chǎn)中，將商業(yè)活性干酵母先復(fù)水活化再接入葡萄汁是最普遍的做法，但由于生產(chǎn)上的便利，部分酒莊也會(huì)采用將活性干酵母直投的方法接種。然而，直投到葡萄醪中的干酵母將面臨高糖、低酸等嚴(yán)峻的生長(zhǎng)環(huán)境。此外，近年來(lái)由于冷浸漬工藝對(duì)葡萄酒顏色和香氣品質(zhì)具有良好的提升作用，在一些葡萄酒產(chǎn)區(qū)受到越來(lái)越多的關(guān)注和應(yīng)用[3]。冷浸漬的時(shí)間一般持續(xù)4～7 d，為了確保該階段葡萄醪的微生物穩(wěn)定，部分生產(chǎn)者嘗試在冷浸漬前進(jìn)行接種，然而較低的溫度會(huì)對(duì)微生物的存活以及生長(zhǎng)造成重大的影響。因此，接入的活性干酵母在不同的工藝條件下能否在發(fā)酵的各階段占據(jù)主導(dǎo)地位仍需驗(yàn)證。為了更好的探究接種方式和溫度對(duì)發(fā)酵的影響，本研究利用WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和Interdelta對(duì)北冰紅葡萄汁4種不同接種方式發(fā)酵過(guò)程中酵母菌群體組成和菌株數(shù)量的變化規(guī)律進(jìn)行了比較研究，確定了所接種的商業(yè)酵母CEC01在發(fā)酵過(guò)程中的主導(dǎo)地位，為工業(yè)生產(chǎn)中活性干酵母的使用提供了一定建議。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 菌株與試劑

釀酒酵母：CEC01（安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)）；葡萄汁：北冰紅葡萄汁（陜西涇陽(yáng)），葡萄汁的初始理化指標(biāo)為糖134.8 g/L，總酸5.6 g/L。發(fā)酵前將葡萄汁糖含量調(diào)整為230 g/L，添加SO230 mg/L。

其他試劑：3,5-二硝基水楊酸，丙三醇，氫氧化鈉，SDS，TritonX-100，EDTA，Tris-HCl。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH值，121℃滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入2%的瓊脂。

WL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Wallerstein Laboratory Nutrient Agar Medium）：酵母菌株的初步形態(tài)分類用WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基[4]。

1.1.3 儀器設(shè)備

磁力攪拌器，常州市國(guó)華電器有限公司；滅菌鍋，上海市申安醫(yī)療器械廠；pH計(jì)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；高速離心機(jī)，湖南湘儀公司；臺(tái)式干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；微量紫外分光光度計(jì)，Nano Drop；PCR儀，Bio RAD；電泳儀，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，SYNGENE。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄汁發(fā)酵

本試驗(yàn)設(shè)置了4種處理方式：①低溫（5℃）干酵母直投浸漬3 d后發(fā)酵；②低溫（5℃）活化接種浸漬3 d后發(fā)酵；③低溫（5℃）浸漬3 d后回溫（20℃）干酵母直投發(fā)酵；④低溫（5℃）浸漬3 d后回溫（20℃）活化接種發(fā)酵。每個(gè)處理設(shè)置一組發(fā)酵。酵母的活化方式如下：取少量葡萄汁于離心管中，水浴加熱至38℃，倒入稱取的酵母活化20 min，待溫度降至與葡萄汁溫差在10℃以內(nèi)，即可將其接種于葡萄汁中。發(fā)酵溫度為20℃，采用DNS法測(cè)量葡萄汁中的糖含量，監(jiān)控發(fā)酵進(jìn)程[5]，發(fā)酵至殘?zhí)沁B續(xù)2 d不變時(shí)視為發(fā)酵結(jié)束。待發(fā)酵結(jié)束后，分析原酒的基本理化指標(biāo)。

1.2.2 菌株的分離

商業(yè)活性干酵母接入后的24 h、啟酵（含糖量開(kāi)始下降時(shí)）、發(fā)酵中期（50%糖消耗）和發(fā)酵末期（糖含量不變時(shí)）4個(gè)時(shí)期進(jìn)行取樣，采用梯度稀釋法涂布于WLN平板上，28℃倒置培養(yǎng)5～7 d。待菌體長(zhǎng)出后，觀察記錄平板上菌落的顏色及形態(tài)，并對(duì)不同培養(yǎng)類型的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。每種處理的每個(gè)時(shí)期挑取約20個(gè)釀酒酵母菌落（共640個(gè)），釀酒酵母的分子鑒定采用5.8S-ITS-RFLP法[6]。所有的釀酒酵母菌株于YEPD液體培養(yǎng)基中活化24 h，再與等量的40%甘油混合后于-70℃保藏。

1.2.3 理化指標(biāo)分析

發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸、酒度和SO2等指標(biāo)參照國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.2.4 酵母菌DNA的提取

取YEPD液體培養(yǎng)基活化后的菌液1 mL于1.5 mL離心管中，12000 r/min離心1 min后棄清液，收集菌體。加入DNA裂解液200 μL，漩渦振蕩2 min后加入DNA提取液（酚-氯仿-異戊醇）200 μL，繼續(xù)漩渦振蕩2 min；再加入TE緩沖液200 μL，輕微搖勻后于12000 r/min離心7 min。將上清液300 μL轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入無(wú)水乙醇900 μL，置于-20℃的冰箱中冷凍10 min；冷凍后的樣品以12000 r/min離心2 min，棄上清液，加入70%的乙醇500 μL清洗DNA沉淀。然后，以12000 r/min離心1 min，棄上清液，待離心管完全干燥后加入ddH2O約20 μL，于-20℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 Interdelta指紋圖譜分析

Interdelta分型法進(jìn)行釀酒酵母分析的PCR體系、電泳條件及數(shù)據(jù)處理參照參考文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方式的發(fā)酵曲線

本研究采取DNS法測(cè)定了葡萄汁中每天的還原糖含量變化，不同接種發(fā)酵處理的發(fā)酵曲線如圖1所示。從發(fā)酵曲線可以看出，回溫接種發(fā)酵在第2天啟酵，低溫接種發(fā)酵在第3天或第4天時(shí)啟酵，各組發(fā)酵均在14 d時(shí)發(fā)酵完全結(jié)束。從接種方式上看，復(fù)水活化接種在啟酵和發(fā)酵速度上快于直投接種發(fā)酵。但從葡萄汁入料到發(fā)酵結(jié)束的整體進(jìn)程來(lái)看，直投發(fā)酵的發(fā)酵曲線較為平滑，發(fā)酵過(guò)程更加平穩(wěn)。

圖1 不同處理方式的發(fā)酵曲線

2.2 發(fā)酵結(jié)束后的理化指標(biāo)

為研究不同接種方式對(duì)葡萄酒理化指標(biāo)的影響，本研究對(duì)發(fā)酵結(jié)束酒樣的后殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸和酒度等理化指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定與比較（表1）。結(jié)果表明，兩種接種方式和兩種溫度組合下的發(fā)酵均能發(fā)酵完全，且各理化指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。不同接種方式發(fā)酵后的酒樣中殘?zhí)?、酒度、總酸和揮發(fā)酸均不存在顯著差異。

2.3 非酵母屬種類及數(shù)量變化

本研究中，除釀酒酵母（類型一）外共發(fā)現(xiàn)了3種非酵母屬酵母，即類型二、類型三和類型四，根據(jù)WLN培養(yǎng)類型可分別鑒定為葡萄汁有孢汗遜酵母、發(fā)酵畢赤酵母和未提及[4]，其在WLN培養(yǎng)上的菌落顏色形態(tài)見(jiàn)圖2。

相關(guān)酵母在WLN培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出的菌落形態(tài)和顏色描述見(jiàn)表2。由表2還可以看出，釀酒酵母的比例最高，為99.09%；發(fā)酵畢赤酵母（類型三）的比例最低，為0.14%。

表1 酒精發(fā)酵結(jié)束時(shí)的理化指標(biāo)

圖2 酵母菌在WLN培養(yǎng)基上的顏色及形態(tài)

表2 酵母菌的WLN形態(tài)描述及鑒定結(jié)果

在4種發(fā)酵方式處理下，非酵母屬可以在接種的24 h、啟酵以及50%糖消耗時(shí)檢測(cè)到，釀酒酵母的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非酵母屬酵母的數(shù)量（圖3）。與回溫接種相比，低溫接種處理中非酵母屬酵母所占的比例更大。低溫干酵母直投發(fā)酵中非酵母屬酵母的數(shù)量最多，在商業(yè)酵母CEC01接種24 h后占比為30%且存活時(shí)間最長(zhǎng)，在啟酵時(shí)仍有20%的非酵母屬酵母存在，直到發(fā)酵末期，非酵母屬酵母才基本消失。而在其他處理方式中，非酵母屬酵母所占比例最大為10%，至50%糖消耗時(shí)基本消失。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中CEC01的定殖能力分析

圖3 不同處理中釀酒酵母與非酵母屬數(shù)量和比例

Interdelta指紋圖譜法操作方便，且擴(kuò)增條帶的電泳圖譜相對(duì)比較穩(wěn)定，因此已經(jīng)逐漸取代了傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，被越來(lái)越多的應(yīng)用于釀酒酵母菌株的鑒定中。使用Interdelta指紋圖譜法，不僅可以在亞種水平上快速對(duì)釀酒酵母進(jìn)行區(qū)分，而且結(jié)果比較準(zhǔn)確[8]。

2.4.1 Interdelta分析釀酒酵母基因型

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同接種條件下、不同發(fā)酵時(shí)期的釀酒酵母進(jìn)行隨機(jī)保存與Interdelta指紋圖譜即不同基因型進(jìn)行分析。如圖4所示，本研究中共鑒定出兩種Interdelta指紋圖譜即兩種基因型。除5泳道、6泳道外，其余泳道（泳道2—4，7—9）的條帶數(shù)量及大小與CEC01（泳道1和10）的一致，可以判斷是同源DNA，即為本試驗(yàn)所接種的釀酒酵母CEC01；而5泳道、6泳道明顯與CEC01不同，即為野生型釀酒酵母。

圖4 Interdelta指紋圖譜

2.4.2 Interdelta分析釀酒酵母菌株比例

通過(guò)對(duì)每個(gè)處理的4個(gè)時(shí)期挑取的20個(gè)釀酒酵母單菌落進(jìn)行Interdelta分型，計(jì)算商業(yè)酵母CEC01在各個(gè)時(shí)期的比例來(lái)確定其定殖能力，其在發(fā)酵過(guò)程中的比例如表3所示。整體而言，不同接種方式和不同溫度處理下，CEC01在酒精發(fā)酵過(guò)程中的菌株比例均占90%以上。對(duì)于低溫直投接種發(fā)酵而言，接種24 h及啟酵時(shí)存在其他野生酵母，表明在此處理方式下CEC01的定殖能力稍弱。結(jié)合2.3部分的結(jié)果，低溫直投接種處理方式中非酵母屬酵母的存活能力較強(qiáng)，該處理方式中可能存在不利于商業(yè)釀酒酵母CEC01定殖的因素。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，從50%糖消耗直至發(fā)酵末期，CEC01占據(jù)絕對(duì)的主導(dǎo)地位（100%）。在低溫活化接種、回溫直投接種和回溫活化接種處理中，CEC01的基因型在所有的取樣點(diǎn)均達(dá)到了100%的比例。

表3 目標(biāo)基因型所占比例 (%)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究4種不同接種條件對(duì)CEC01發(fā)酵特征的影響及發(fā)酵過(guò)程4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期所接種釀酒酵母的定殖能力，說(shuō)明CEC01具有極強(qiáng)的發(fā)酵性能，能主導(dǎo)酒精發(fā)酵的完成。主要結(jié)論如下：

（1）復(fù)水活化接種發(fā)酵在啟酵和發(fā)酵速度上快于直投接種發(fā)酵，但是，直投接種發(fā)酵的發(fā)酵過(guò)程更加平穩(wěn)。

（2）在低溫直投接種的處理方式中，非酵母屬酵母的數(shù)量最多，且存活時(shí)間較長(zhǎng)，可能會(huì)影響葡萄酒的風(fēng)味。

（3）通過(guò)Interdelta指紋圖譜分析，發(fā)酵過(guò)程中，目標(biāo)基因型占總釀酒酵母基因型的90%以上，說(shuō)明CEC01具有極強(qiáng)的定殖能力，在發(fā)酵中占據(jù)主導(dǎo)地位。

（4）利用CEC01活性干酵母進(jìn)行的4種發(fā)酵所得到的酒樣均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，這4種接種方式均可應(yīng)用于葡萄酒的生產(chǎn)，生產(chǎn)者可根據(jù)需要選擇在冷浸漬時(shí)期低溫接種或者干酵母直投的方式進(jìn)行接種來(lái)生產(chǎn)葡萄酒。