朱艷芝，陳曉晨，劉蘆鵬，張 邦，周亞楠，孫久鵬，馬文鋒

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽 471023）

飼用酶制劑作為重要的飼料添加劑，在消除飼料原料的抗?fàn)I養(yǎng)因子、降低食糜黏度、提高飼料利用率等方面發(fā)揮重要作用 （Jensen等，1957）。在養(yǎng)豬生產(chǎn)過程中，仔豬消化系統(tǒng)發(fā)育不完善，體內(nèi)消化酶和胃酸分泌不足，易引起胰蛋白酶、淀粉酶等消化酶活性降低，導(dǎo)致“仔豬早期斷奶綜合征”（杜忍讓等，2009）。淀粉酶可降低底物黏度并分解底物，生成麥芽糖和少量葡萄糖，而纖維素酶可以激活斷奶仔豬內(nèi)源酶的分泌（楊友坤等，2009）。

淀粉是植物細(xì)胞重要的儲(chǔ)能物質(zhì)，是玉米-豆粕型日糧的主要供能來源；纖維素是植物細(xì)胞壁的組成成分，不但難以被動(dòng)物 （特別是單胃動(dòng)物）消化，而且會(huì)增加食糜黏性，導(dǎo)致日糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率降低（曾禮華等，2008）。淀粉酶能將底物水解，最終生成果糖和葡萄糖；纖維素酶能將植物細(xì)胞壁溶解，分解纖維素和半纖維素，并將大分子多糖降解為有利于腸道消化吸收的小分子物質(zhì)。因此，本試驗(yàn)采用體外酶解法，模擬仔豬胃腸道消化吸收的生理特點(diǎn)，探討淀粉酶和纖維素酶對玉米-豆粕型日糧還原糖生成量及干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的影響，以期為淀粉酶和纖維素酶的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 酶制劑 試驗(yàn)所用淀粉酶和纖維素酶均為單酶，購自洛陽牧為生物科技有限公司。酶活性分別為：淀粉酶4000 U/g、纖維素酶100000 U/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及日糧組成 本試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)單酶分別設(shè)置5個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度分別設(shè)置5個(gè)重復(fù)，其中淀粉酶的設(shè)置濃度分別為 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 U/g，纖維素酶的設(shè)置濃度分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 U/g。

試驗(yàn)原料組成參考仔豬常用日糧配制，原料組成及營養(yǎng)水平見表1。利用粉碎機(jī)對混合后的飼料粉碎，至95%以上過60目篩網(wǎng)，置于包裝袋內(nèi)密封，備用。

表1 日糧組成和營養(yǎng)水平

1.3 試劑的配制 0.1 mol/L HCl-54 mmol/LNaCl緩沖溶液（pH 2.0）：取 8.5 mL 濃鹽酸、3.2 g NaCl使其充分溶于蒸餾水中，1000 mL容量瓶定容。

0.1 mol/L磷酸緩沖液 （pH 7.0）：取 5.38 g NaH2PO4·2H2O溶于500 mL蒸餾水，為A液；取8.66 g Na2HPO4·H2O溶于500 mL蒸餾水，為B液。將A、B液混合，加蒸餾水定容至1000 mL。

胰蛋白復(fù)合酶溶液：稱取磷酸二氫鉀6.8 g，加蒸餾水500 mL使其充分溶解，再用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，取胰蛋白酶10 g（Sigma，P7545），加入適量蒸餾水使其溶解，將兩種溶液混合后，加蒸餾水定容至1000 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。1.4 體外酶解操作過程 模擬胃的消化：準(zhǔn)確稱取1 g飼料樣品（精確至0.0001 g），置于透析袋后編號，放入150 mL三角瓶中，加入20 mL HCl-NaCl緩沖液（0.1 mol/L，pH 2.0）和 0.1 g 胃蛋白酶（Sigma，P7000），用封口膜封緊瓶口。在厭氧條件下，將三角瓶置于39℃恒溫?fù)u床內(nèi)振蕩6 h，振蕩頻率為70 r/min。

模擬小腸酶解過程：體外消化6 h后，暫停搖床，取出三角瓶打開封口膜，向三角瓶中準(zhǔn)確加入20 mL 磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）和 2.5 mL胰蛋白復(fù)合酶溶液，在溶液pH為7.0、厭氧環(huán)境下，封好三角瓶的瓶口，置于39℃恒溫?fù)u床中振蕩24 h，振蕩頻率為70 r/min。

還原糖生成量測定：24 h后取出三角瓶中透析袋，室溫靜置20 min，吸取1 mL上清液于試管中，加入DNS檢測液2 mL，于水浴鍋中煮沸5 min，取出，冷卻至室溫，加入9 mL蒸餾水，混勻。移液槍移取混合液于比色皿中，在540 nm光波處測定各溶液的吸光度值，通過還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中的還原糖含量。

還 原 糖 生 成 量 /（mg/g） =（C ×VT）/（m ×VS） ×1000。

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線所查糖量，mg；VT為提取液的體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g；VS為測定時(shí)的溶液體積，mL。

干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的測定：使用絕干稱重的濾紙對三角瓶中的酶解殘?jiān)婵粘闉V，將抽濾后的殘?jiān)蜑V紙置于105℃烘箱中烘干至恒重，使用半自動(dòng)定氮儀測定粗蛋白質(zhì)含量。干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解率的計(jì)算公式如下：

干物質(zhì)酶解率/%=（M0-M1）/M0×100；

粗蛋白質(zhì)酶解率/%=（M0×CP0-M1×CP1）/（M0×CP0）×100。

式中：M0為飼料樣品干物質(zhì)重量，g；M1為未酶解殘?jiān)晌镔|(zhì)重量，g；CP0為飼料樣品粗蛋白質(zhì)含量，%；CP1為未酶解殘?jiān)值鞍踪|(zhì)含量，%。1.5 數(shù)據(jù)分析 以重復(fù)為單位，采用SAS（2001）中GLM模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過線性（Linear）和二次（Quadratic）效應(yīng)評估不同濃度淀粉酶和纖維素酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的影響，處理間顯著性判定水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)平均值以LSMEANS表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加淀粉酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的影響 由表2可知，試驗(yàn)日糧中添加淀粉酶，可顯著提高試驗(yàn)日糧還原糖的生成量（二次，P＜0.05）和干物質(zhì)酶解效率（線性，P＜0.05）。當(dāng)?shù)矸勖柑砑恿繛?.8 U/g時(shí)，斷奶仔豬日糧還原糖生成量最高，為57.93 mg/g；淀粉酶添加量由0.4 U/g增加至2 U/g時(shí)，日糧中的干物質(zhì)酶解率逐漸升高。

根據(jù)體外酶解試驗(yàn)結(jié)果，建立還原糖生成量和干物質(zhì)酶解率（Y，%）與淀粉酶添加水平（X，U/g）的回歸方程（表3）。由表3可知，隨著日糧中淀粉酶比例的提高，干物質(zhì)酶解率與淀粉酶含量存在線性方程關(guān)系，根據(jù)線性方程得出：淀粉酶的最適添加量為0.8 U/g；還原糖生成量與淀粉酶含量存在二次曲線關(guān)系，根據(jù)二次方程得出：淀粉酶最佳添加量為1.05 U/g。

表2 淀粉酶對試驗(yàn)日糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

表3 淀粉酶與干物質(zhì)酶解率及還原糖生成量的關(guān)系

2.2 添加纖維素酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解效率的影響 由表4可知，試驗(yàn)日糧中添加纖維素酶對日糧中干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)酶解率無顯著影響（P＞0.05），但能顯著提高日糧還原糖的生成量（二次，P＜0.05）。當(dāng)纖維素酶添加量為3 U/g時(shí)，試驗(yàn)日糧還原糖生成量最高，為59.90 mg/g。

表4 纖維素酶對試驗(yàn)日糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響

根據(jù)體外酶解試驗(yàn)結(jié)果，建立還原糖生成量（Y，%）與纖維素酶添加水平（X，U/g）的回歸方程（表5）。由表5可知，纖維素酶添加量與還原糖生成量存在二次曲線關(guān)系，根據(jù)二次方程得出：纖維素酶最佳添加量為3.08 U/g，此時(shí)還原糖生成量為56.73 mg/g。

表5 纖維素酶與還原糖生成量的關(guān)系

3 討論

Yi等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在玉米-豆粕型日糧中分別添加100 ppm和150 ppm的淀粉酶飼喂仔豬，可顯著提高仔豬日增重、日采食量和飼料轉(zhuǎn)化率。 Pack 等（1998）和張憲（2018）研究表明，玉米-豆粕型日糧中添加含有淀粉酶的復(fù)合酶可提高玉米的利用效率，這可能與淀粉酶破壞細(xì)胞壁，釋放營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。沈水寶和馮定遠(yuǎn)（2005）研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加200 g/t消化酶（含有淀粉酶）后腸道絨毛形態(tài)由扁平狀變?yōu)橹笭?，絨毛數(shù)量變多，表明飼喂酶制劑可以一定程度地改善仔豬的腸道絨毛生長狀況。

Meng等（2005）通過體外酶解消化法，證明纖維素酶、果膠酶等酶制劑能夠提高豆粕、小麥等作物的干物質(zhì)酶解率。Regmi等（2009）使用纖維素酶對21個(gè)大麥樣品進(jìn)行體外消化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體外能量消化率相對誤差較小，且可以提高飼糧干物質(zhì)在豬腸道中的消化率。Emiola等（2009）研究表明，在玉米-大麥-小麥DDGS型豬飼糧中添加非淀粉多糖酶（含有纖維素酶），可以改善生長豬的生長性能及干物質(zhì)和粗纖維的總表觀消化率。

在進(jìn)行飼用酶制劑效果評價(jià)時(shí)，動(dòng)物試驗(yàn)可以較準(zhǔn)確地反映酶制劑對畜禽生長性能的影響，但這種方法較難重復(fù)，很難在短時(shí)間對大量樣品進(jìn)行分析，且生物學(xué)影響因素多，結(jié)果變異大，限制了該方法的廣泛應(yīng)用（葉宏濤和劉國華，2007）。而體外模擬消化法具有試驗(yàn)條件可控、干擾因素少、重復(fù)性好以及與生物法相關(guān)性高等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)常被用來進(jìn)行酶制劑的作用效果評價(jià) （李東衛(wèi)等，2013）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加一定劑量的淀粉酶，可以顯著提高玉米-豆粕型日糧的還原糖生成量（二次，P＜0.05）和干物質(zhì)酶解率（線性，P＜0.05）。當(dāng)添加一定劑量的纖維素酶時(shí)，可以顯著提高其還原糖生成量（二次，P＜0.05），表明日糧中添加淀粉酶和纖維素酶可以提高飼料的營養(yǎng)物質(zhì)利用率。

4 結(jié)論

淀粉酶添加濃度由0.4 U/g提高至2.0 U/g時(shí)，顯著提高了干物質(zhì)酶解率（線性，P＜0.05）和還原糖生成量（二次，P＜0.05）；纖維素酶添加濃度由1.0 U/g提高至5.0 U/g時(shí)，顯著提高了還原糖生成量（二次，P ＜ 0.05）。