劉希旻， 任 健， 童應凱*， 陳添傲， 平煒杰， 付同帥， 顧逸飛

（1.天津農學院農學與資源環(huán)境學院生物技術系，天津 300384；2.天津農學院基礎科學學院，天津 300384）

花椒籽富含蛋白質和粗脂質，并且資源豐富，是較好的脂肪源及蛋白源，然而花椒籽含有花椒酰胺類（麻味）物質和揮發(fā)油（香味）物質，會影響飼料的適口性?；ń孵０冯m然有抗炎抑菌的功能，但動物如果長期攝入會對胃部及腸道造成損傷（葉敏，2015）?；ń孵０奉愇镔|中包括羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素等。其中以羥基-α-山椒素的含量為酰胺類物質檢測的標準，主要采用紫外分光光度法檢測花椒酰胺的含量。本文通過對實驗室保藏菌種產朊假絲酵母（Candida utilis）、白地霉（Geotrichum candidum）、布拉迪酵母（Saccharomyces cerevisiae boulardii）及溫莎啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的培育和篩選，旨在確定降解花椒酰胺類物質的菌種，并通過正交試驗，尋找菌種的最佳生長條件及最佳生長元素添加量。以最大化地利用農后廢物花椒籽，為養(yǎng)殖業(yè)提供一種植物蛋白和脂肪源的新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 花椒籽粉、麩皮，市場購買；鮮花椒油，購自成都陳麻婆；石油醚、甲醛（分析純），甲醇（優(yōu)級純），甲醇、正己烷（色譜純），購自天津大茂；葡萄糖（分析純），購自天津北方天醫(yī)；酵母浸膏（生化試劑，天津英博）；蛋白胨（生化試劑，湖北安琪）；酵母浸粉LP0021（生化試劑，英國OXOID）；硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、氫氧化鈉（均為分析純，天津風船）；產朊假絲酵母、白地霉、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母，均為天津農學院生物技術系實驗室保藏菌種。

1.2 儀器與設備 粉碎機 （浙江榮浩）；分析天平（北京賽多利斯）；旋轉蒸發(fā)儀RE-2000A （上海亞榮）；紫外可見分光光度計（北京普析通用）；低速離心機L550（湖南湘儀）；恒溫水浴鍋HH-4（金壇市瑞華）；KH5200DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津歐諾）；飛利浦紫外線燈（上海賴氏）；生物潔凈工作臺（蘇州安泰）；血細胞計數(shù)板（上海求精）；生化培養(yǎng)箱SHP-250B（江蘇宏凱）。

1.3 培養(yǎng)基 YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%、酵母浸膏 1%、蛋白胨 2%，pH 6.0，121℃滅菌 20 min。

沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖4%、蛋白胨1%，pH自然，121℃滅菌20 min。

中性紅油脂培養(yǎng)基：花椒油10%、酵母浸粉1%、硫酸銨0.2%、磷酸氫二鉀0.1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸亞鐵0.01%、0.1%中性紅指示液0.3 mL，pH 7.2～7.5，121℃滅菌20 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：花椒籽粉9 g、麩皮1 g、蒸餾水10 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 花椒籽中油脂含量的測定 國標規(guī)定飼料粗脂肪含量為10%以上（含10%）。本試驗采用抽提法測定花椒籽中油脂含量（馬榮萱等，2006）。稱取8 g花椒籽粉，濾紙包好置于索氏提取器中，加入80 mL石油醚，置90℃水浴，回流虹吸15次停止加熱，待冷卻后，減壓蒸餾，直至無提取劑氣味，即為花椒籽油脂（表1）。

表1 花椒籽中油脂含量測定表

1.4.2 油脂降解菌的篩選 飼料中脂肪過多，會引起動物消化不良、腹瀉，且不利于存儲，因此需進行油脂降解菌的篩選。將產朊假絲酵母、白地霉、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母接種于中性紅油脂培養(yǎng)基上，置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h后進行觀察。

1.4.3 花椒酰胺類物質標準品的制備 羥基-α-山椒素制備參照劉福權等（2017）的方法?；ń酚团c甲醇按體積比1:20，于40℃，160 r/min振蕩1 h后，超聲5 min。4000 r/min離心15 min，取上清液加入正己烷，體積比為1:2，萃取3次除去香味物質。將下層液過堿性三氧化二鋁層析柱，所得液經0.22μm濾膜過濾后，進行減壓蒸干，得到粗提取物。將粗提取物溶于10 mL色譜純甲醇，于紫外燈下15 cm處照射4 h，再進行減壓蒸干。經甲醛滴定法平行檢驗 （江燕竹，2016），獲得純度為98.21%的羥基-α-山椒素標準品。

1.4.4 花椒酰胺類物質標準曲線的測定 將制取的羥基-α-山椒素標準品溶于一定量的甲醇中，再配制成不同濃度的溶液，在254 nm下測定吸光度，繪制標準曲線（圖1）。

圖1 羥基-α-山椒素含量標準曲線

1.4.5 花椒酰胺類降解菌的篩選 將產朊假絲酵母、布拉迪酵母、溫莎啤酒酵母接種于50 mL YEPD培養(yǎng)基中，白地霉接種于50 mL沙氏培養(yǎng)基中，于搖床中30℃，150 r/min培養(yǎng)24 h后，移取1 mL種子液接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中。置于生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵產物各精確稱取1.00 g移入10 mL離心管中，加入5 mL甲醇，在40℃下浸提4 h，其間不斷搖動，離心后取上清液稀釋，在254 nm處測定其吸光度值（付陳梅等，2003）（表 2）。

表2 不同菌種降解花椒酰胺類物質殘留量比m較g/g

1.4.6 微量元素正交試驗 對產朊假絲酵母、白地霉，單一菌種及混合菌種進行L9（34）的固體發(fā)酵生長元素添加條件試驗設計見表3。

表3 微量元素添加條件正交試驗設計表%

1.4.7 生長條件正交試驗 對產朊假絲酵母進行L9（34）的生長條件試驗設計見表 4。

表4 產朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵生長條件正交試驗設計表

2 結果與分析

微量元素正交試驗結果分析見表5和表6。由R值可知，影響產朊假絲酵母降解的微量元素添加條件依次為葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂；影響白地霉降解的微量元素添加條件依次為硫酸銨、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀。

表5 產朊假絲酵母、白地霉單一菌種發(fā)酵微量元素添加條件正交試驗結果

表6 產朊假絲酵母、白地霉單一菌種發(fā)酵微量元素添加條件顯著性比較（LSD法）

由R值可知，影響產朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵降解的微量元素添加條件依次為硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖（表7、表8）。

由R值可知，影響產朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵降解的生長條件依次為接種量、時間、料液比、溫度（表 9、表 10）。

3 結論

本試驗結果表明，固體發(fā)酵降解花椒酰胺類物質的最優(yōu)混合菌種為產朊假絲酵母和白地霉。對比單一菌種發(fā)酵，混合菌種降解花椒酰胺類物質時間短，降解能力高，并大大降低了花椒籽粉中的揮發(fā)油類（香味）物質。經正交試驗確定混合菌種的最佳降解生長條件為：溫度28℃，料液比1:1，接種量10%，時間24 h。生長元素添加最佳條件為：（NH4）2SO40%，KH2PO40.2%，Mg-SO40.01%，葡萄糖0.5%。經重復試驗驗證，花椒酰胺類物質平均殘留量為3.5776 mg/g。且發(fā)酵產物經感官性評價無花椒揮發(fā)油氣味，麻味明顯下降，油脂含量適中。

表7 產朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵微量元素添加條件正交試驗結果

表9 產朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵生長條件正交試驗結果

表8 產朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵微量元素添加條件顯表著性比較（LSD法）

10 產朊假絲酵母、白地霉混合發(fā)酵生長條件顯著性比較（LSD法）