龔發(fā)源 ， 徐智鵬 ，， 陳毛清 ，曹詩國 ， 熊 鋒 ， 曾雨雷 ， 胡駿鵬 ，*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.安琪酵母（崇左）有限公司，廣西崇左 532201）

從20世紀(jì)初開始，飼用益生菌以其無毒副作用、無殘留、無環(huán)境污染、能有效提高動(dòng)物生產(chǎn)性能而被廣泛研究并用于動(dòng)物生產(chǎn)。目前用于畜禽飼料的益生菌，主要包括芽孢桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、片球菌、鏈球菌等革蘭氏陽性菌以及釀酒酵母菌、克魯維酵母菌等 （Anadon等，2006）。其中釀酒酵母是安全使用時(shí)間較長且具有顯著益生作用的飼用微生物，其菌體蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%以上，在畜牧業(yè)中一直作為單細(xì)胞蛋白的主要來源而被廣泛使用（聶琴，2018）。此外釀酒酵母作為益生菌可以提高動(dòng)物對(duì)飼料干物質(zhì)、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等有機(jī)物和磷酸的消化率，還能提高飼料中礦物質(zhì)利用率，有助于動(dòng)物充分利用飼料中的養(yǎng)分，同時(shí)還能有效改善家畜腸胃的菌群結(jié)構(gòu)（潘寶海等，2010；王學(xué)東等，2006）、吸附腸道病原菌（Tiago等，2012）、增強(qiáng)家畜的免疫力和抗病力（Halas等，2012）等。

然而，動(dòng)物胃腸道中存在的胃酸、膽鹽及各種消化酶類是天然存在的屏障，飼用益生菌能否在動(dòng)物消化道中發(fā)揮生理功能，首要在于能否有效抵抗胃腸道的天然屏障，在消化道內(nèi)定植或者保持有效活菌含量。因此，本研究選取多種釀酒酵母菌株，建立體外模擬胃腸道環(huán)境模型，對(duì)釀酒酵母菌株在模擬胃腸道環(huán)境中的適應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為飼用釀酒酵母科學(xué)有效的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 釀酒酵母菌株及活性干酵母樣品：Sc 1、Sc 2、Sc 3、Sc 4 均由安琪酵母股份有限公司提供，其中Sc 1菌株保存于安琪酵母股份有限公司生物技術(shù)研究院菌種保藏中心，菌種編號(hào)BW；Sc 2、Sc 3、Sc 4保存于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心 （CCTCC），菌種編號(hào)分別為CCTCC M2051226、CCTCCM2016460、CCTCC M2012116。

1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 酵母膏胨葡萄糖（YPD）液體和固體培養(yǎng)基：1% 酵母提取物，2%蛋白胨，2% 葡萄糖，溶解于1 L蒸餾水中，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉，滅菌待用。

豬膽鹽（膽酸含量≥65%），購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶（酶活力≥1200 U/g）、胰蛋白酶（酶活力≥5000 U/g），氯化鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉等化學(xué)試劑（生化級(jí)），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 從4℃冰箱中取出斜面培養(yǎng)基保存的釀酒酵母菌株，室溫解凍后，接種于YPD斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化，再將活化好的菌種接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)培。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期末期后作為活化酵母菌懸液，待用。

1.2.2 37℃生長試驗(yàn) 將活化的菌懸液接種于YPD液體培養(yǎng)基（pH自然），接種量1‰，37℃下?lián)u床培養(yǎng)，0、4、8、12、24 h 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)（cfu/mL）。

1.2.3 酸性環(huán)境適應(yīng)性試驗(yàn) 將活化的菌液接種于不同 pH 液體培養(yǎng)基 （pH 1.0、2.0、3.0、4.0），使用自然pH作為對(duì)照，接種量1‰，最適生長溫度下?lián)u床培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)（cfu/mL）。

1.2.4 人工胃液配制 取質(zhì)量濃度為0.1 kg/L的鹽酸16.4 mL，加蒸餾水稀釋，調(diào)節(jié)溫度為25℃，用pH計(jì)精密調(diào)節(jié)pH為2.0。然后參考GB/T 17811-1999相關(guān)方法，加入生化級(jí)胃蛋白酶（1%），充分溶解后，用孔徑0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即為人工胃液。

1.2.5 人工腸液配制 Na2HPO41.36 g，加水100 mL溶解，用0.1 kg/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，加水稀釋至200 mL，121℃滅菌15 min，然后加入0.3%膽鹽和0.1%生化級(jí)胰蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.22μm微孔濾膜過濾除菌，冷藏備用。

1.2.6 活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù) 用無菌生理鹽水對(duì)樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，每支樣品選擇3個(gè)稀釋梯度，每個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)，采用平板計(jì)數(shù)法，吸取0.1 mL進(jìn)行無菌涂布，靜置15 min后30℃倒置恒溫培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)有效數(shù)在30～300個(gè)的平板菌落數(shù)，然后將結(jié)果換算成cfu/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 37℃生長試驗(yàn) 由圖1可知，四種釀酒酵母菌株在37℃的YPD肉湯條件下均能夠生長增殖，0～4 h為適應(yīng)期，4～12 h為對(duì)數(shù)生長期，16～24 h為平臺(tái)生長期，36 h顯示活菌數(shù)相對(duì)平臺(tái)期已經(jīng)出現(xiàn)衰亡。四種釀酒酵母菌株之間對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Sc 1對(duì)數(shù)生長速率最大，菌株迅速擴(kuò)增，Sc 2次之；Sc 4能夠達(dá)到最大活菌數(shù)108cfu/mL，Sc 2次之；Sc 1雖然在對(duì)數(shù)生長期快速增殖，但是最大活菌數(shù)卻只有107cfu/mL左右。綜合而言，Sc 2在37℃具有較好的生長適應(yīng)性，Sc 4能夠達(dá)到最大活菌數(shù)。

圖1 不同釀酒酵母菌株在37℃條件下生長曲線

2.2 酸性環(huán)境適應(yīng)性試驗(yàn) 如圖2所示，與自然pH的對(duì)照組相比，pH 1.0的條件下培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)基本都在接種值105cfu/mL以下，說明pH 1.0的條件會(huì)顯著抑制4株釀酒酵母的生長；pH 2.0條件下培養(yǎng)24 h后，除Sc 3和Sc 4外活菌數(shù)都在接種值105cfu/mL左右，無明顯生長增殖；而pH 3.0和pH 4.0的條件中，4株釀酒酵母均能夠正常生長。另外不同pH條件下對(duì)比4株釀酒酵母菌株之間生長情況發(fā)現(xiàn)，Sc 1對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性最差，其他3株釀酒酵母都顯著（P＜0.05）或者極顯著（P ＜ 0.01）優(yōu)于 Sc 1；而 Sc 2、Sc 3、Sc 4 之間并沒有顯著性差異（P＞0.05），說明除Sc 1外，其他3株釀酒酵母都具有較好的酸性環(huán)境適應(yīng)性。

圖2 不同釀酒酵母菌株酸性環(huán)境適應(yīng)性

2.3 人工胃液耐受性試驗(yàn) 人工胃液耐受性試驗(yàn)選擇4株釀酒酵母菌株為種子生產(chǎn)的商品化活性干酵母產(chǎn)品（酵母活細(xì)胞數(shù)≥200億個(gè)/g），通過平板計(jì)數(shù)加入人工胃液后0、2、4 h的酵母活菌數(shù)，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)0 h的存活率，結(jié)果如表1所示。在pH 2.0，胃蛋白酶1%的模擬人工胃液中共同孵育2 h后，4種釀酒酵母的相對(duì)存活率為50%～70%，其中Sc 3的存活率最高，達(dá)到69.72%，Sc 1存活率最低，為50.07%，兩者差異極顯著（P＜0.01）。而共同孵育4 h后，4種釀酒酵母的相對(duì)存活率為45%～61%，Sc 4最高，存活率為60.58%，Sc 1最低，存活率為46.16%。綜合而言，0～2 h時(shí)間段內(nèi)，釀酒酵母衰亡明顯，而2～4 h內(nèi)相對(duì)存活率下降5%左右；其中，Sc 4在模擬人工胃液中的耐受性綜合表現(xiàn)最佳。

表1 人工胃液對(duì)不同釀酒酵母相對(duì)存活率的影響%

2.4 人工腸液耐受性試驗(yàn) 人工腸液耐受性試驗(yàn)同樣是使用商品化活性干酵母產(chǎn)品 （酵母活細(xì)胞數(shù)≥200億個(gè)/g），通過平板計(jì)數(shù)計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)相對(duì)0 h的存活率，結(jié)果如表2所示，在pH 6.8、膽鹽濃度0.3%、胰蛋白酶0.1%的模擬人工腸液中共同孵育2 h后，相對(duì)存活率為54%～72%，Sc 3的存活率最高，Sc 1存活率最低，兩者差異極顯著（P＜0.01）。共同孵育4 h后，4種釀酒酵母的相對(duì)存活率為45%～67%，Sc 3最高，存活率為66.25%，Sc 1最低，存活率為45.27%。綜合而言，Sc 3在模擬人工腸液中的耐受性最佳。

表2 人工腸液對(duì)不同釀酒酵母相對(duì)存活率的影響%

3 討論

釀酒酵母作為一個(gè)種屬，本身包含多種菌株，不同菌株之間在生理生化特性上存在一定的差異。優(yōu)良的飼用釀酒酵母需要具有耐受動(dòng)物胃腸道內(nèi)環(huán)境的能力，主要包括胃液壓力和腸液壓力，否則無法在動(dòng)物胃腸道中發(fā)揮應(yīng)有的生物學(xué)功效。胃腸道環(huán)境耐受性試驗(yàn)已經(jīng)成為飼用益生菌篩選的一個(gè)必要內(nèi)容。李順（2007）篩選飼用活性酵母時(shí)，通過pH 2.1或者含豬膽鹽0.3%的麥芽汁培養(yǎng)基中接種酵母菌，培養(yǎng)24 h，選擇能夠生長增殖的作為具有抗逆性的目標(biāo)菌株；王鵬（2011）對(duì)分離的釀酒酵母菌株耐受性研究發(fā)現(xiàn)，該菌株在pH 2.0麥芽汁培養(yǎng)基中存活率為58.92%，pH 3.0麥芽汁培養(yǎng)基中存活率為91.95%，pH 4～7的培養(yǎng)基中都可以正常增殖；同時(shí)在0.6%膽鹽濃度麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，依然能夠增殖；肖新云等（2016）研究漢遜德巴利酵母在胃酸、腸膽鹽環(huán)境的耐受性時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌株在pH 1.0的PDA培養(yǎng)基中無存活，pH 1.5、2.0、2.5活菌數(shù)與對(duì)照組比較下降明顯 （P＜0.01），耐膽鹽試驗(yàn)中，該菌株在0.4%的高膽鹽濃度PDA培養(yǎng)基中仍然存活，活菌數(shù)隨膽鹽濃度增加而降低，具有良好的抗酸、抗膽鹽特性；王學(xué)東等（2018）研究不同用途酵母菌環(huán)境適應(yīng)性差異發(fā)現(xiàn)，飼用酵母菌的酸脅迫耐受性和膽酸鹽耐受性都優(yōu)于面包酵母和酒精酵母，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同菌株的酸脅迫耐受性可能與其細(xì)胞內(nèi)Na+、K+濃度變化有密切關(guān)系，膽酸鹽耐受性可能與其胞內(nèi)海藻糖積累量密切相關(guān)，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，4株釀酒酵母菌株在體外模擬胃腸道環(huán)境的耐受性是不同的，Sc 2、Sc 3、Sc 4比Sc 1具有更好的酸性環(huán)境適應(yīng)性。此外本研究考慮到養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中的實(shí)際情況，分別使用其活性干酵母制劑在考察模擬胃腸道環(huán)境中的耐受性，發(fā)現(xiàn)不同用途的釀酒酵母的耐受性存在較大差異。綜上，同一種屬的菌種之間其環(huán)境抗逆性是存在差異的，因此選擇畜禽養(yǎng)殖專用的益生菌，一定要綜合評(píng)價(jià)菌株本身對(duì)于胃腸道環(huán)境的耐受性，這是其發(fā)揮改善腸道菌群，促進(jìn)飼料消化等生理功能的前提。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同釀酒酵母在體外模擬胃腸道內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性不同，釀酒酵母Sc 2、Sc 3、Sc 4比釀酒酵母Sc 1具有更好的胃腸道耐受性。因此在篩選和應(yīng)用飼用釀酒酵母過程中需要篩選具有胃腸道環(huán)境耐受性的菌株，而相關(guān)的體外模擬研究方法還需要不斷的優(yōu)化驗(yàn)證。