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        老齡化對單側腎切除術后大鼠青霉素排泄的影響

        2019-03-01 08:24:00張興宇隋鮮鮮陳天王見之
        中國老年學雜志 2019年4期
        關鍵詞:組內老齡青霉素

        張興宇 隋鮮鮮 陳天 王見之

        (復旦大學 1基礎醫(yī)學國家級實驗教學示范中心,上海 200032;2上海醫(yī)學院2013級臨床醫(yī)學八年制)

        臨床上,活體腎移植主要供體之一的擴展標準供體(ECD)年齡較大〔1,2〕,在國內主要是患者的父母或者兄弟姐妹,人群年齡大、機體耐受差。另外,對于罹患腎細胞癌(RCC)的老齡個體,腎切除術亦為目前臨床常用的手段〔3〕。腎切除術如何影響老齡個體術后腎功能和腎臟對抗生素類藥物的排泄能力及老齡化是否加重術后腎損傷目前尚無全面報道。青霉素作為臨床腎切除術后的常規(guī)用藥之一,主要通過腎臟排泄。本研究探究老齡大鼠單側腎切除術后抗生素類藥物排泄的規(guī)律和腎功能的變化。

        1 材料與方法

        1.1實驗動物與分組 清潔級健康青齡雄性SD大鼠〔(262.5±28.2)g,3月齡〕16只,清潔級健康老齡雄性SD大鼠〔(616.3±42.4)g,18月齡〕16只,購自復旦大學實驗動物科學部。將大鼠稱重,并隨機分為4組:青齡對照組,不手術給予青霉素,1萬U/100 g體重,青齡手術組,行右側腎切除術并給予青霉素,1萬U/100 g體重;老齡對照組,不手術給予青霉素,1萬U/100 g體重,老齡手術組,行右側腎切除術并給予青霉素,1萬U/100 g體重,每組各8只大鼠。所有大鼠在標準條件下(溫度23℃±2℃,濕度60%±5%)適應性飼養(yǎng)7 d,標準飼料,自由取水。

        1.2主要溶液及試劑 20%烏拉坦溶液、生理鹽水由復旦大學基礎醫(yī)學國家級實驗教學示范中心提供;注射用青霉素鈉購自華北制藥股份有限公司;肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;藤黃微球菌(ATCC9341)、抗生素檢定培養(yǎng)基2號購自上海科瑪嘉微生物技術有限公司。

        1.3單側腎切除大鼠模型制備 手術組大鼠經20%烏拉坦麻醉(0.7 ml/100 g,腹腔注射),俯臥位固定于鼠手術臺,并用電熱板保持術中溫度。于右側后胸廓下、靠近脊柱1.0~1.5 cm處行約2.0 cm斜向外下方切口,逐層分離大鼠皮膚、肌肉、背腹膜、腎脂肪囊,暴露右側腎臟并結扎腎蒂,切除整個右腎,稱重后甲醛固定備用。明膠海綿止血,分別縫合肌肉與皮膚。實驗步驟:術前3 d各組腹腔注射青霉素,于注射后60 min尾靜脈采血。手術當日,對照組(青齡,老齡)腹腔注射青霉素,60 min后采血。手術組大鼠(青齡,老齡)術后待動物自然蘇醒后,青霉素注射、60 min后采血,方法同前。術后連續(xù)給予手術組青霉素(4萬U/只)5 d以防止感染。術后10 d后各組青霉素注射、60 min后采血,方法同前。血液樣本于4℃冰箱靜置1 h后,3 000 r/min離心10 min,取上清,放入-80℃冰箱保存待測。

        1.4血清青霉素濃度測定 根據《中華人民共和國藥典2010年版》管碟法測定〔4〕,質控菌種為藤黃微球菌(ATCC9341),肉湯培養(yǎng)基27℃擴增至OD600 nm=0.5后放入4℃冰箱保存待用。無菌條件下倒平板(直徑90 mm),底層為20 ml抗生素檢定培養(yǎng)基2號,待底層凝固后,按照菌液與培養(yǎng)基體積之比1∶50配比菌層5 ml,四象限法放置牛津杯(規(guī)格10 mm×8 mm×6 mm),牛津杯內加入20 μl血清樣品。另配置青霉素標準液,每個牛津杯內加入20 μl用于制作標準曲線。將培養(yǎng)基平穩(wěn)置于27℃培養(yǎng)20 h,游標卡尺測量抑菌圈的直徑,根據直線擬合所得青霉素的標準曲線計算血清中的青霉素濃度。

        1.5血清肌酐、尿素氮濃度測定 肌酐測定的原理為苦味酸比色法,10倍量鎢酸沉淀劑將血清中的蛋白沉淀,離心取上清后加入苦味酸試劑和0.75 mol/L氫氧化鈉試劑,37℃水浴10 min,波長510 nm,光徑1 cm,測定吸光度。尿素氮測定的原理為脲酶法,血清經脲酶于37℃水浴中作用10 min后,加入酚顯色劑和堿性次氯酸鈉,再次37℃水浴10 min,波長640 nm,光徑1 cm,測定吸光度。得到各管的OD值,根據下列公式計算相應濃度。

        1.6大鼠腎臟重量測量 實驗完成后取各組左腎并稱重,甲醛固定備用,與手術切除的右腎的重量做統(tǒng)計學分析。

        1.7腎臟組織病理學及腎臟損傷評分 將甲醛固定的腎組織制成3 μm厚度的蘇木素-伊紅(HE)切片。每張切片隨機選取5個視野,按照以下標準取平均值進行病理學診斷:腎小球、腎小管、腎間質均正常評分為0分;損傷部分占比鏡下觀察部分33%以下的評分為1分(輕度損傷);占33%~67%為2分(中度損傷);占67%以上為3分(重度損傷)〔5〕。

        1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

        2 結 果

        2.1青、老齡大鼠手術前、后青霉素濃度比較 根據術后采血樣本的抑菌環(huán)直徑(表1),擬合得青霉素濃度C(U/L)對數值與抑菌環(huán)直徑d(mm)的線性關系為lgC=0.104 7×d+2.657 2(R2=0.996,見圖1)。術前3 d,青齡大鼠和老齡大鼠組內血清青霉素濃度均無顯著差異(均P>0.05),但是手術組內老齡大鼠的血清青霉素濃度顯著高于青齡大鼠(P<0.01)。手術當日,即刻測得血清青霉素濃度,青齡大鼠和老齡大鼠單腎對青霉素排泄明顯下降(青齡組內P<0.001,老齡組內P<0.05)。術后10 d時,手術組青齡大鼠血清青霉素濃度與對照組無顯著差異(P>0.05),但老齡手術組大鼠顯著高于老齡對照組(P<0.01),同時,手術組內老齡大鼠血清青霉素濃度顯著高于青齡大鼠(P<0.001)。見表1。

        2.2青、老齡大鼠手術前后腎功能生化指標比較 與術前3 d Cr相比,青齡、老齡手術組大鼠術后10 d時血清Cr、BUN濃度均無顯著變化(P>0.05);老齡手術組大鼠的術后10 d時血清Cr、BUN濃度顯著高于青齡手術組(P<0.01,P<0.001)。見表2。

        圖1 青霉素濃度(U/L)對數值-抑菌環(huán)直徑(mm)的線性回歸

        時間抑菌環(huán)直徑(mm)青齡對照組青齡手術組老齡對照組老齡手術組青霉素(U/L)青齡對照組青齡手術組老齡對照組老齡手術組術前3 d9.79±0.269.89±0.2014.44±1.7614.48±1.684 813.65±483.954 925.17±477.0514 750.48±693.4014 911.38±680.321)手術當日9.80±0.2813.70±0.8215.28±3.1519.71±0.834 825.27±485.4112 355.26±552.883)18 072.41±971.4652 518.64±554.604)術后10 d9.90±0.219.88±0.5314.48±1.6818.80±0.884 937.06±478.204 910.35±516.6314 911.38±680.3242 249.52±561.072)5)

        與青齡手術組比較:1)P<0.01,2)P<0.001,與青齡對照組比較:3)P<0.001,與老年對照組比較:4)P<0.05,5)P<0.01;表2同

        表2 青、老齡大鼠手術前后腎功能生化指標比較

        2.3青、老齡大鼠手術前后腎臟質量比較 青齡大鼠術后10 d時左側腎臟質量為(1.66±0.19)g,與術前右側腎臟質量(1.35±0.13)g相比明顯增加(P<0.05)。老齡大鼠術后10 d時左側腎臟質量為(2.00±0.10)g,與術前右側腎臟質量(1.45±0.16)g相比明顯增加(P<0.01)。老齡大鼠術后10 d時左側腎臟質量顯著大于青齡大鼠(P<0.05)。

        2.4各組大鼠腎臟組織病理學及腎臟損傷評分 青齡對照組和手術組鏡下可見腎小球形態(tài)正常、小管清晰未狹窄,未見間質炎癥反應。老齡對照組腎臟組織內可見少量單個核細胞浸潤,腎小球形態(tài)較正常、小管上皮未見腫脹或萎縮。但是,老齡手術組腎臟組織內可見腎小球腫脹、萎縮,周圍有明顯纖維化及瘢痕,腎小管上皮腫脹脫落、管腔狹窄,最重要的是可見腎小管、間質小灶性損傷、炎癥反應及明顯纖維化,并伴有大量單個核細胞浸潤,見圖2。腎臟病理評分顯示,青齡大鼠組內腎臟損傷評分無明顯差異〔對照組(0.25±0.16)分、手術組(0.63±0.26)分,P>0.05〕,老齡大鼠組內手術組術后10 d時腎臟損傷明顯強于對照組〔對照組(1.38±0.18)分、手術組(2.50±0.27)分,P<0.01〕。手術組內老齡大鼠損傷評分明顯高于青齡大鼠(P<0.001)。

        圖2 各組腎臟組織病理學及腎臟損傷評分(黑箭頭:纖維化,×10)

        3 討 論

        相對于青年個體,老年個體腎切除術后各時段生存率均較低〔6〕,說明在同樣腎切除術應激條件下,老齡化可引起腎切除個體死亡率的增加,即意味著臨床上應當針對老年腎切除個體加強術后監(jiān)測及護理。本實驗說明腎切除術本身并不影響腎小球濾過功能,這是由于健存腎代償性肥大及腎血漿流量導致的高灌注,腎小球處于高濾過狀態(tài),以維持機體排泄需求〔7〕。因此,針對老齡個體,本實驗證實了腎切除并不對腎功能產生明顯削弱作用。

        老年患者腎切除術后護理有必要使用抗生素防止感染〔8〕,但需減量使用抗生素類藥物。老齡個體在圍術期對各種藥物的排泄規(guī)律及藥物機體相互作用有待進一步探討。

        本實驗提示老齡化可能加重腎切除術大鼠健存腎的損傷。老齡化可能誘發(fā)腎切除術后慢性纖維化損傷。但是,老齡化誘發(fā)的腎小管、間質纖維化是否會導致術后腎病的發(fā)生,則有待研究。

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