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        老齡化對單側(cè)腎切除術(shù)后大鼠青霉素排泄的影響

        2019-03-01 08:24:00張興宇隋鮮鮮陳天王見之
        中國老年學(xué)雜志 2019年4期
        關(guān)鍵詞:組內(nèi)老齡青霉素

        張興宇 隋鮮鮮 陳天 王見之

        (復(fù)旦大學(xué) 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海 200032;2上海醫(yī)學(xué)院2013級臨床醫(yī)學(xué)八年制)

        臨床上,活體腎移植主要供體之一的擴(kuò)展標(biāo)準(zhǔn)供體(ECD)年齡較大〔1,2〕,在國內(nèi)主要是患者的父母或者兄弟姐妹,人群年齡大、機(jī)體耐受差。另外,對于罹患腎細(xì)胞癌(RCC)的老齡個體,腎切除術(shù)亦為目前臨床常用的手段〔3〕。腎切除術(shù)如何影響老齡個體術(shù)后腎功能和腎臟對抗生素類藥物的排泄能力及老齡化是否加重術(shù)后腎損傷目前尚無全面報道。青霉素作為臨床腎切除術(shù)后的常規(guī)用藥之一,主要通過腎臟排泄。本研究探究老齡大鼠單側(cè)腎切除術(shù)后抗生素類藥物排泄的規(guī)律和腎功能的變化。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組 清潔級健康青齡雄性SD大鼠〔(262.5±28.2)g,3月齡〕16只,清潔級健康老齡雄性SD大鼠〔(616.3±42.4)g,18月齡〕16只,購自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部。將大鼠稱重,并隨機(jī)分為4組:青齡對照組,不手術(shù)給予青霉素,1萬U/100 g體重,青齡手術(shù)組,行右側(cè)腎切除術(shù)并給予青霉素,1萬U/100 g體重;老齡對照組,不手術(shù)給予青霉素,1萬U/100 g體重,老齡手術(shù)組,行右側(cè)腎切除術(shù)并給予青霉素,1萬U/100 g體重,每組各8只大鼠。所有大鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下(溫度23℃±2℃,濕度60%±5%)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由取水。

        1.2主要溶液及試劑 20%烏拉坦溶液、生理鹽水由復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心提供;注射用青霉素鈉購自華北制藥股份有限公司;肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;藤黃微球菌(ATCC9341)、抗生素檢定培養(yǎng)基2號購自上??片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司。

        1.3單側(cè)腎切除大鼠模型制備 手術(shù)組大鼠經(jīng)20%烏拉坦麻醉(0.7 ml/100 g,腹腔注射),俯臥位固定于鼠手術(shù)臺,并用電熱板保持術(shù)中溫度。于右側(cè)后胸廓下、靠近脊柱1.0~1.5 cm處行約2.0 cm斜向外下方切口,逐層分離大鼠皮膚、肌肉、背腹膜、腎脂肪囊,暴露右側(cè)腎臟并結(jié)扎腎蒂,切除整個右腎,稱重后甲醛固定備用。明膠海綿止血,分別縫合肌肉與皮膚。實(shí)驗(yàn)步驟:術(shù)前3 d各組腹腔注射青霉素,于注射后60 min尾靜脈采血。手術(shù)當(dāng)日,對照組(青齡,老齡)腹腔注射青霉素,60 min后采血。手術(shù)組大鼠(青齡,老齡)術(shù)后待動物自然蘇醒后,青霉素注射、60 min后采血,方法同前。術(shù)后連續(xù)給予手術(shù)組青霉素(4萬U/只)5 d以防止感染。術(shù)后10 d后各組青霉素注射、60 min后采血,方法同前。血液樣本于4℃冰箱靜置1 h后,3 000 r/min離心10 min,取上清,放入-80℃冰箱保存待測。

        1.4血清青霉素濃度測定 根據(jù)《中華人民共和國藥典2010年版》管碟法測定〔4〕,質(zhì)控菌種為藤黃微球菌(ATCC9341),肉湯培養(yǎng)基27℃擴(kuò)增至OD600 nm=0.5后放入4℃冰箱保存待用。無菌條件下倒平板(直徑90 mm),底層為20 ml抗生素檢定培養(yǎng)基2號,待底層凝固后,按照菌液與培養(yǎng)基體積之比1∶50配比菌層5 ml,四象限法放置牛津杯(規(guī)格10 mm×8 mm×6 mm),牛津杯內(nèi)加入20 μl血清樣品。另配置青霉素標(biāo)準(zhǔn)液,每個牛津杯內(nèi)加入20 μl用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將培養(yǎng)基平穩(wěn)置于27℃培養(yǎng)20 h,游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑,根據(jù)直線擬合所得青霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中的青霉素濃度。

        1.5血清肌酐、尿素氮濃度測定 肌酐測定的原理為苦味酸比色法,10倍量鎢酸沉淀劑將血清中的蛋白沉淀,離心取上清后加入苦味酸試劑和0.75 mol/L氫氧化鈉試劑,37℃水浴10 min,波長510 nm,光徑1 cm,測定吸光度。尿素氮測定的原理為脲酶法,血清經(jīng)脲酶于37℃水浴中作用10 min后,加入酚顯色劑和堿性次氯酸鈉,再次37℃水浴10 min,波長640 nm,光徑1 cm,測定吸光度。得到各管的OD值,根據(jù)下列公式計算相應(yīng)濃度。

        1.6大鼠腎臟重量測量 實(shí)驗(yàn)完成后取各組左腎并稱重,甲醛固定備用,與手術(shù)切除的右腎的重量做統(tǒng)計學(xué)分析。

        1.7腎臟組織病理學(xué)及腎臟損傷評分 將甲醛固定的腎組織制成3 μm厚度的蘇木素-伊紅(HE)切片。每張切片隨機(jī)選取5個視野,按照以下標(biāo)準(zhǔn)取平均值進(jìn)行病理學(xué)診斷:腎小球、腎小管、腎間質(zhì)均正常評分為0分;損傷部分占比鏡下觀察部分33%以下的評分為1分(輕度損傷);占33%~67%為2分(中度損傷);占67%以上為3分(重度損傷)〔5〕。

        1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

        2 結(jié) 果

        2.1青、老齡大鼠手術(shù)前、后青霉素濃度比較 根據(jù)術(shù)后采血樣本的抑菌環(huán)直徑(表1),擬合得青霉素濃度C(U/L)對數(shù)值與抑菌環(huán)直徑d(mm)的線性關(guān)系為lgC=0.104 7×d+2.657 2(R2=0.996,見圖1)。術(shù)前3 d,青齡大鼠和老齡大鼠組內(nèi)血清青霉素濃度均無顯著差異(均P>0.05),但是手術(shù)組內(nèi)老齡大鼠的血清青霉素濃度顯著高于青齡大鼠(P<0.01)。手術(shù)當(dāng)日,即刻測得血清青霉素濃度,青齡大鼠和老齡大鼠單腎對青霉素排泄明顯下降(青齡組內(nèi)P<0.001,老齡組內(nèi)P<0.05)。術(shù)后10 d時,手術(shù)組青齡大鼠血清青霉素濃度與對照組無顯著差異(P>0.05),但老齡手術(shù)組大鼠顯著高于老齡對照組(P<0.01),同時,手術(shù)組內(nèi)老齡大鼠血清青霉素濃度顯著高于青齡大鼠(P<0.001)。見表1。

        2.2青、老齡大鼠手術(shù)前后腎功能生化指標(biāo)比較 與術(shù)前3 d Cr相比,青齡、老齡手術(shù)組大鼠術(shù)后10 d時血清Cr、BUN濃度均無顯著變化(P>0.05);老齡手術(shù)組大鼠的術(shù)后10 d時血清Cr、BUN濃度顯著高于青齡手術(shù)組(P<0.01,P<0.001)。見表2。

        圖1 青霉素濃度(U/L)對數(shù)值-抑菌環(huán)直徑(mm)的線性回歸

        時間抑菌環(huán)直徑(mm)青齡對照組青齡手術(shù)組老齡對照組老齡手術(shù)組青霉素(U/L)青齡對照組青齡手術(shù)組老齡對照組老齡手術(shù)組術(shù)前3 d9.79±0.269.89±0.2014.44±1.7614.48±1.684 813.65±483.954 925.17±477.0514 750.48±693.4014 911.38±680.321)手術(shù)當(dāng)日9.80±0.2813.70±0.8215.28±3.1519.71±0.834 825.27±485.4112 355.26±552.883)18 072.41±971.4652 518.64±554.604)術(shù)后10 d9.90±0.219.88±0.5314.48±1.6818.80±0.884 937.06±478.204 910.35±516.6314 911.38±680.3242 249.52±561.072)5)

        與青齡手術(shù)組比較:1)P<0.01,2)P<0.001,與青齡對照組比較:3)P<0.001,與老年對照組比較:4)P<0.05,5)P<0.01;表2同

        表2 青、老齡大鼠手術(shù)前后腎功能生化指標(biāo)比較

        2.3青、老齡大鼠手術(shù)前后腎臟質(zhì)量比較 青齡大鼠術(shù)后10 d時左側(cè)腎臟質(zhì)量為(1.66±0.19)g,與術(shù)前右側(cè)腎臟質(zhì)量(1.35±0.13)g相比明顯增加(P<0.05)。老齡大鼠術(shù)后10 d時左側(cè)腎臟質(zhì)量為(2.00±0.10)g,與術(shù)前右側(cè)腎臟質(zhì)量(1.45±0.16)g相比明顯增加(P<0.01)。老齡大鼠術(shù)后10 d時左側(cè)腎臟質(zhì)量顯著大于青齡大鼠(P<0.05)。

        2.4各組大鼠腎臟組織病理學(xué)及腎臟損傷評分 青齡對照組和手術(shù)組鏡下可見腎小球形態(tài)正常、小管清晰未狹窄,未見間質(zhì)炎癥反應(yīng)。老齡對照組腎臟組織內(nèi)可見少量單個核細(xì)胞浸潤,腎小球形態(tài)較正常、小管上皮未見腫脹或萎縮。但是,老齡手術(shù)組腎臟組織內(nèi)可見腎小球腫脹、萎縮,周圍有明顯纖維化及瘢痕,腎小管上皮腫脹脫落、管腔狹窄,最重要的是可見腎小管、間質(zhì)小灶性損傷、炎癥反應(yīng)及明顯纖維化,并伴有大量單個核細(xì)胞浸潤,見圖2。腎臟病理評分顯示,青齡大鼠組內(nèi)腎臟損傷評分無明顯差異〔對照組(0.25±0.16)分、手術(shù)組(0.63±0.26)分,P>0.05〕,老齡大鼠組內(nèi)手術(shù)組術(shù)后10 d時腎臟損傷明顯強(qiáng)于對照組〔對照組(1.38±0.18)分、手術(shù)組(2.50±0.27)分,P<0.01〕。手術(shù)組內(nèi)老齡大鼠損傷評分明顯高于青齡大鼠(P<0.001)。

        圖2 各組腎臟組織病理學(xué)及腎臟損傷評分(黑箭頭:纖維化,×10)

        3 討 論

        相對于青年個體,老年個體腎切除術(shù)后各時段生存率均較低〔6〕,說明在同樣腎切除術(shù)應(yīng)激條件下,老齡化可引起腎切除個體死亡率的增加,即意味著臨床上應(yīng)當(dāng)針對老年腎切除個體加強(qiáng)術(shù)后監(jiān)測及護(hù)理。本實(shí)驗(yàn)說明腎切除術(shù)本身并不影響腎小球?yàn)V過功能,這是由于健存腎代償性肥大及腎血漿流量導(dǎo)致的高灌注,腎小球處于高濾過狀態(tài),以維持機(jī)體排泄需求〔7〕。因此,針對老齡個體,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了腎切除并不對腎功能產(chǎn)生明顯削弱作用。

        老年患者腎切除術(shù)后護(hù)理有必要使用抗生素防止感染〔8〕,但需減量使用抗生素類藥物。老齡個體在圍術(shù)期對各種藥物的排泄規(guī)律及藥物機(jī)體相互作用有待進(jìn)一步探討。

        本實(shí)驗(yàn)提示老齡化可能加重腎切除術(shù)大鼠健存腎的損傷。老齡化可能誘發(fā)腎切除術(shù)后慢性纖維化損傷。但是,老齡化誘發(fā)的腎小管、間質(zhì)纖維化是否會導(dǎo)致術(shù)后腎病的發(fā)生,則有待研究。

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