王凌飛

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸部，天津 300193）

我國卒中發(fā)病率約為每年274/10萬人，其中69.6%屬于缺血性卒中（腦梗死）［1］，是老年人致殘、致死的首要原因。雖然腦梗死的發(fā)病率很高，但其有效的治療方法卻非常局限，目前僅限于機械取栓和靜脈溶栓，以再通血管、恢復血流、降低神經(jīng)缺血損傷。然而機械取栓的技術(shù)與設(shè)備尚待進一步成熟；而溶栓的治療因時間窗短、血管再通率低、出血轉(zhuǎn)化風險高等特點也限制了其應(yīng)用范圍。因此，擴大溶栓藥物如阿替普酶（rt-PA）治療窗、減輕副作用的治療措施可使更多的腦梗死患者獲益。

近年來研究顯示，神經(jīng)干細胞（NSCs）具有多效性，對亞急性期和恢復期腦梗死均有治療作用。NSCs通過替代受損神經(jīng)元［2］或通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎因子等“旁觀者效應(yīng)”來保護神經(jīng)細胞、抑制微環(huán)境的細胞毒性成分而促進神經(jīng)功能的修復［3］。越來越多的臨床前研究表明，NSCs移植是一種有效的治療腦梗死的方法，通過減輕血腦屏障（BBB）滲漏、減輕神經(jīng)炎癥、促進神經(jīng)發(fā)生和血管生成等多種機制發(fā)揮促進神經(jīng)功能恢復的作用［4］。但是在疾病的不同階段和不同的給藥途徑，NSCs移植的治療效果也有所不同。本文即綜述NSCs移植治療腦梗死的效果及存在問題。

1 NSCs簡介

NSCs具有自我更新和多向分化潛能，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。在哺乳動物腦內(nèi)，神經(jīng)發(fā)生只出現(xiàn)在特定腦區(qū)，包括海馬齒狀回的顆粒下層、側(cè)腦室的室管膜下區(qū)和小腦的外生發(fā)層。小腦一旦發(fā)育完成，其外生發(fā)層在嚙齒類動物出生后3周和人類2歲時就會消失［5］。嚙齒類動物側(cè)腦室室管膜下區(qū)中的神經(jīng)祖細胞在整個生命過程中均有增殖、分化的能力，并遷移至嗅球，成為嗅球中新的功能神經(jīng)元［6］。但人類和嚙齒類動物在成年后神經(jīng)發(fā)生的程度和持續(xù)時間等方面存在差異。人類海馬［7］和紋狀體［8］內(nèi)的神經(jīng)發(fā)生一直存在。雖然成人側(cè)腦室室管膜下區(qū)中存在NSCs，但未發(fā)現(xiàn)其向嗅球遷移［9］。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷能刺激神經(jīng)發(fā)生。缺血等病理性損傷導致腦內(nèi)NSCs和神經(jīng)祖細胞增殖、分化和遷移增加。對成人的研究發(fā)現(xiàn)，缺血性損傷后靠近側(cè)腦室壁的腦實質(zhì)及側(cè)腦室室管膜下區(qū)中增殖的神經(jīng)祖細胞增多［10］。但不論嚙齒類動物還是人類，成年后的神經(jīng)發(fā)生非常有限［11］，不能提供足夠的細胞來修復缺血損傷造成的神經(jīng)元丟失。因此，移植體外培養(yǎng)的NSCs是促進腦梗死后神經(jīng)功能修復的有效辦法。

2 NSCs移植治療腦梗死

在腦梗死早期，腦內(nèi)出現(xiàn)一系列復雜的病理生理學級聯(lián)反應(yīng)，導致腦內(nèi)微環(huán)境隨時間推移發(fā)生著顯著的變化，因此NSCs移植的時機決定了其起效的機制。外源性NSCs可通過替換死亡或受損細胞、或通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和抗炎因子等“旁觀者效應(yīng)”來保護神經(jīng)細胞并促進神經(jīng)功能的修復。

替代受損神經(jīng)元和其它腦細胞是外源性NSCs移植治療腦梗死的主要目標。研究顯示，移植的NSCs最終能夠與宿主神經(jīng)元形成有效的突觸連接并顯示成熟神經(jīng)元的電生理特性［12］。此外，外源性NSCs的“旁觀者效應(yīng)”在改善腦梗死后神經(jīng)功能方面更加有效。NSCs通過分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子表達，可改變神經(jīng)元存活微環(huán)境，促進神經(jīng)元存活及加強神經(jīng)環(huán)路的塑性［13-14］。如NSCs可分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF），BDNF可促進卒中后的神經(jīng)保護、血管生成、神經(jīng)發(fā)生和功能恢復［15］。NSCs還可分泌分子神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTFs），NTFs能維持神經(jīng)元的生長、存活，并在細胞外基質(zhì)重塑、細胞生成和增殖等方面發(fā)揮重要作用；NTFs還可保護敏感的神經(jīng)組織免受損傷［16］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，能促進血管生成，并對神經(jīng)組織產(chǎn)生保護和修復作用；作為內(nèi)皮細胞的有效促分裂原和存活因子，VEGF能有效抵抗神經(jīng)缺血損傷。抑制VEGF可導致NSCs介導的神經(jīng)保護作用顯著降低［17］。研究表明，NSCs分泌的VEGF通過激活星形膠質(zhì)細胞中的PI3K/Akt通路上調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1（GLT-1）的表達，以促進缺血性細胞外谷氨酸的去除，從而改善神經(jīng)缺血損傷并增強神經(jīng)可塑性［17］。此外，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等其他神經(jīng)生長因子也具有維持神經(jīng)元生存，在神經(jīng)損傷后促進神經(jīng)元存活與再生的作用［18］。

2.1 NSCs移植對腦梗死早期的治療作用 再灌注損傷、BBB破壞和免疫細胞浸潤導致缺血早期神經(jīng)組織的進一步損傷［19］。目前臨床常采用藥物治療（如米諾環(huán)素）來減少急性/亞急性神經(jīng)損傷［20］。研究顯示，NSCs移植可降低缺血損傷的嚴重程度、減少神經(jīng)細胞死亡，是一種有效的神經(jīng)保護策略。對大腦中動脈閉塞（MCAO）的小鼠的研究表明，卒中后48 h，NSCs移植后24 h，腦內(nèi)顯示出炎癥反應(yīng)減輕、BBB損傷下降，并且這種改善作用可維持較長時間［13-14，21-25］。

2.1.1 對BBB的保護作用 NSCs早期移植有助于防止缺血再灌注后對BBB的損害。與未處理的MCAO對照組相比，MCAO后24 h將人NSCs移植到小鼠海馬，可見NSCs大量遷移至病灶，導致梗死體積縮小，BBB損傷減少［13］；這種快速反應(yīng)表明NSCs具有抗炎作用。人NSCs移植的小鼠顯示小膠質(zhì)細胞活化減少以及炎癥因子如IL-6、IL-1β和巨噬細胞炎癥蛋白-1α的表達降低［13］。

外周IgG在缺血損傷后可通過受損BBB滲漏到腦實質(zhì)中；在缺血再灌注后24 h將人iPSCNSCs移植到嚙齒動物卒中模型中，可見腦內(nèi)IgG水平降低［21］。MMPs（基質(zhì)金屬蛋白酶）能損傷BBB內(nèi)皮細胞間緊密連接的功能，導致BBB滲漏；卒中后接受NSCs移植的嚙齒動物腦中MMPs有所降低［21］。Adjudin具有抑制神經(jīng)炎癥的功能，成年小鼠MCAO后24 h將Adjudin預處理的小鼠胚胎NSCs移植到紋狀體中導致梗死體積減少和BBB破壞改善［22］。這些均表明NSCs移植有助于保持BBB的完整性，并防止卒中后進一步的神經(jīng)損傷［21-22］。已知rt-PA在4.5 h窗口期之外加劇神經(jīng)細胞死亡和BBB損傷，因此使用NSCs移植來維持BBB的完整性，可擴大rt-PA的治療窗以使更多卒中患者受益。

2.1.2 對炎癥的抑制作用 腦梗死后，不僅外周免疫細胞通過受損的BBB浸潤至腦實質(zhì)，腦內(nèi)活化的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞也分泌炎癥因子進一步加劇神經(jīng)炎癥反應(yīng)。NSCs移植在腦梗死亞急性期可以通過抑制腦內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)來改善預后［14，23-24］。NSCs通過下調(diào)炎癥調(diào)節(jié)分子如 TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、IL-1β、IL-6和Iba-1等來防止中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［14，24］。人 iPSC-NSCs移植可顯著降低卒中小鼠缺血核心區(qū)及周圍半暗帶內(nèi)的活化的小膠質(zhì)細胞的數(shù)量；移植組動物腦內(nèi)活化的星形膠質(zhì)細胞水平也較低［25］。同樣，NSCs治療的腦梗死小鼠腦內(nèi)CD45+和Iba-1+/MHCⅡ免疫細胞數(shù)量顯著減少［24］。以上結(jié)果提示，NSCs可以通過調(diào)節(jié)細胞外微環(huán)境和減少炎癥反應(yīng)來降低缺血損傷。

2.2 NSCs移植對早期腦梗死的改善效果 腦梗死早期進行NSCs移植可調(diào)節(jié)神經(jīng)元存活微環(huán)境，以發(fā)揮神經(jīng)保護作用。同時，早期NSCs移植也能促進神經(jīng)修復，在缺血性損傷后的數(shù)天乃至數(shù)周內(nèi)都可觀察到神經(jīng)功能的改善。

2.2.1 改善神經(jīng)功能 將人NSCs在卒中后1 d移植到大鼠腦中，并采用改良神經(jīng)損傷嚴重程度評分（mNSS）評估大鼠的神經(jīng)功能，發(fā)現(xiàn)移植后2周大鼠的神經(jīng)行為學評分有顯著改善［26］。MCAO后24 h接受人NSCs移植的小鼠與未移植的卒中對照相比，損傷后48 h其感覺運動、平衡能力及和運動協(xié)調(diào)能力均已迅速改善，且損傷后1個月中運動功能得以持續(xù)改善［13］。提示早期干預對于腦梗死患者功能恢復至關(guān)重要。其他研究也證實，MCAO后24 h移植iPSC-NSCs到小鼠腦中可改善長期的神經(jīng)學結(jié)果［21］；將外源性原代 NSCs［13］或 iPSC-NSCs［21］移植到動物的紋狀體和皮質(zhì)，可促進腦梗死動物神經(jīng)功能恢復［13，21，27］。此外，將 NSCs直接顱內(nèi)移植到卒中模型動物的海馬體內(nèi)（神經(jīng)發(fā)生正在進行），能促進NSCs快速遷移到受損區(qū)域并促進功能修復［13，21］。有條件永生化的NSCs（小鼠NSC系克隆36，MHP36）MCAO后2 d移植能促進小鼠神經(jīng)功能恢復；進一步評估小鼠神經(jīng)功能直至MCAO后28 d，可見足部運動功能及運動協(xié)調(diào)性均明顯改善［28］。此外，在亞急性期（MCAO后 3～4 d）進行NSCs移植也導致梗死體積減少和神經(jīng)功能改善［29］?？傊@些臨床前研究表明，在腦卒中亞急性期的NSCs移植顯著改善神經(jīng)功能。

2.2.2 促進血管生成 NSCs移植可通過促進血管生成以幫助神經(jīng)功能恢復。卒中后人NSCs的早期移植（第1天）促進了大鼠的血管生成；在NSCs移植后第14天，移植大鼠缺血區(qū)新生內(nèi)皮細胞數(shù)量增加，提示血管新生增加［26］。缺血皮質(zhì)早期移植（MCAO后6 h）小鼠NSCs（用IL-6預處理）能促進血管生成，移植后第14天可見血管密度增加［27］。MCAO后 24 h靜脈注射人胚胎NSCs，在損傷后28 d發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞數(shù)量及血管生成增加［30］。老年大鼠MCAO后24 h將小鼠胚胎NSCs移植到同側(cè)紋狀體中，能夠減少梗死體積，其原因與增加VEGF表達和增強血管生成有關(guān)［31］。以上提示在卒中早期進行NSCs治療能夠促進血管形成。

2.2.3 神經(jīng)發(fā)生 在卒中早期進行NSCs移植能通過替代受損神經(jīng)元或通過內(nèi)源性神經(jīng)源性反應(yīng)的增強，而有益于神經(jīng)功能的恢復［21，30-34］。

MCAO后48 h將外源性人胎兒NSCs植入大鼠同側(cè)紋狀體中，可見移植細胞在第6周和第14周分化為成神經(jīng)細胞和成熟神經(jīng)元，同時可見來自室管膜下區(qū)的成神經(jīng)細胞增殖和遷移增加［32］。大鼠MCAO后當天即移植人NSCs，可見移植的NSCs分化為成熟神經(jīng)元，并替代海馬中丟失的神經(jīng)元［33］。大鼠MCAO后24 h靜脈移植人NSCs也觀察到類似的結(jié)果［30］。在MCAO后24 h將小鼠NSCs移植到大鼠的同側(cè)紋狀體中也增加了內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，并減少了梗死體積［31，34］。值得注意的是，雖然在研究中觀察到有限的細胞替代，但NSCs分化成功能性神經(jīng)元需要較長時間，并且尚無足夠證據(jù)證明細胞替代對于NSCs介導的神經(jīng)恢復是至關(guān)重要的。有研究表明，卒中后24 h行顱內(nèi)iPSC-NSCs植入，在移植后30 d植入細胞仍然存活，但絕大多數(shù)移植細胞仍然是巢蛋白陽性NSCs，只有少量分化為神經(jīng)元［21］。因此，受損神經(jīng)元替代可能不是腦梗死亞急性階段NSCs移植后產(chǎn)生有益卒中結(jié)果的主要因素。

2.3 NSCs移植治療腦梗死恢復期的效果 目前的臨床研究集中于在卒中恢復期給予NSCs移植對于神經(jīng)保護的作用。在嚙齒類動物卒中模型中，炎性細胞因子在MCAO的急性/亞急性期高表達，但隨著時間的推移而降低，并在MCAO后12 d恢復到幾乎正常的水平［35］。在卒中后7 d給予腦梗死動物模型NSCs移植，可以避免急性/亞急性期缺血再灌注造成的細胞毒性損傷［36］。多個研究表明，NSCs移植通過促進神經(jīng)發(fā)生、介導血管生成等多種機制在腦梗死恢復期中發(fā)揮治療作用。

2.3.1 血管生成 證據(jù)表明，在卒中恢復期進行外源性NSCs移植能促進血管生成和新血管形成。新生大鼠腦梗死后7 d將iPSC-NSCs移植到半暗帶中，可見在梗死周圍區(qū)域表達更多VEGF；移植后14 d，血管生成增加［37］。成年裸鼠缺血性腦卒中損傷后第7天行NSCs移植，發(fā)現(xiàn)導致新生血管形成與NSCs表達VEGF呈時空對應(yīng)關(guān)系［38］。MCAO后7 d將IL-6預處理的胎鼠NSCs移植到梗死周圍皮質(zhì)中，也發(fā)現(xiàn)NSCs通過STAT3介導的 VEGF上調(diào)促進血管生成［27］。MCAO后7 d移植過表達SDF-1α的iPSC衍生的NSCs，缺血腦組織中血管新生顯著增加［39］。在梗死后第7天靜脈注射NSCs的大鼠在梗死后28 d較對照大鼠有明顯增加的血管生成，其腦毛細血管中表達更高的VEGF及其受體VEGFR2［40］。上述研究表明，外源性NSCs通過增加血管新生和形成，促進了卒中的恢復；且這種結(jié)果與VEGF旁分泌增強相關(guān)。

2.3.2 神經(jīng)發(fā)生 腦梗死后神經(jīng)功能損傷是腦內(nèi)大量神經(jīng)細胞死亡的結(jié)果。因此，通過神經(jīng)發(fā)生替代丟失的神經(jīng)細胞是NSCs移植治療腦梗死恢復期的治療機制之一。臨床前研究表明，移植的NSCs可分化為成熟神經(jīng)元并與宿主神經(jīng)元發(fā)生功能整合，形成完整的神經(jīng)環(huán)路，使得移植動物的神經(jīng)功能明顯改善［12，37，41-44］。新生大鼠腦梗死后7 d移植iPSC-NSCs，在梗死后21 d可見NSCs已分化成神經(jīng)元［37］。接受iPSC-NSCs植入的大鼠肢體運動功能恢復的更好［37，45］。MCAO后9 d移植人iPSC衍生的神經(jīng)上皮樣干細胞，能夠在大鼠和小鼠的腦中分化成具有電生理活性的成熟神經(jīng)元；并且在移植后4周，移植細胞接受來自周圍內(nèi)源性神經(jīng)元的突觸輸入，擴展其軸突投射，促進了運動功能的恢復［12］。在MCAO后14 d移植人ESC-NSCs可增強幼年和老年大鼠室管膜下區(qū)的內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生［41］。延遲移植人ESC衍生的神經(jīng)前體細胞能減少梗死體積并改善大鼠的運動功能［42］。MCAO 后 4周，NSCs移植能顯著增加腦梗死大鼠腦紋狀體中成神經(jīng)細胞的內(nèi)源性增殖［43］，并導致劑量相關(guān)的神經(jīng)功能改善［44］。

當然，并非所有移植的NSCs都能夠在腦中存活并分化為成熟神經(jīng)元［46］。MCAO后7 d移植NSCs，雖然移植的NSCs與宿主神經(jīng)元形成突觸連接并顯示成熟神經(jīng)元的電生理特性，但在宿主腦中成功分化和存活的NSCs數(shù)量低于預期［12］。也有研究顯示，梗死后4～12周，腦中移植的NSCs數(shù)量顯著減少［14］。

綜上所述，如何促進梗死后移植入腦的NSCs分化成功能性神經(jīng)細胞并長期存活而發(fā)揮功能，仍需進一步努力。盡管一些研究已經(jīng)觀察到NSCs移植后可替代原有失能神經(jīng)元，但目前尚不清楚這種細胞替代機制是否是改善腦梗死結(jié)局的主要原因。而移植細胞存活率低與腦梗死恢復期神經(jīng)功能改善相關(guān)的報道也表明，NSCs移植的治療潛力可能以促進宿主神經(jīng)發(fā)生和血管生成為主。

3 小結(jié)

目前，有研究者提出利用NSCs的生物學特性來跨越目前臨床治療腦梗死的一些障礙，如NSCs可與其它干預措施（如rt-PA）配合使用。NSCs具有抗炎、抗細胞凋亡、促血管生成和促神經(jīng)發(fā)生的作用，可改善rt-PA溶栓治療相關(guān)的一些副作用。雖然NSCs移植明顯改善了腦梗死動物的神經(jīng)功能，但仍需積累更多臨床前研究資料以推動相關(guān)臨床試驗的開展。此外，還需關(guān)注NSCs移植治療合并其它病癥的腦梗死的效果。如糖尿病不僅會增加腦梗死的風險，還會使腦梗死后死亡率增加3～4倍［47］。由于BBB損傷風險加大，糖尿病患者也無法接受rt-PA的治療［47］。在腦梗死的嚙齒類動物模型中，糖尿病小鼠腦梗死后MMP9 mRNA和蛋白活性較對照組增加更快［48］。此外，糖尿病還是一種炎癥性疾病，糖尿病患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)增強；糖尿病小鼠模型體內(nèi)炎癥標志物明顯增加［48］。因此，需要更多的治療方法來治療合并其它病癥的腦梗死。此外，移植NSCs治療腦梗死還必須解決某些安全問題。例如，一項小鼠MCAO后24 h將iPSCs移植到同側(cè)紋狀體的研究發(fā)現(xiàn)移植細胞癌變［49］。因此，盡可能減小致癌風險，也是NSCs移植治療腦梗死需要考慮的重要問題。

目前，臨床上正在開展幾項關(guān)于NSCs移植的人體試驗［50-52］。一項針對人NSCs的Ⅰ期臨床試驗顯示NSCs移植治療沒有安全性問題，并取得了一些治療的進展［51］。期待不久的將來，NSCs移植能讓更多的腦梗死患者受益。