鄭佳奇，劉欣宇，佟文英，張?zhí)烊A，崔吉燾，朱燦，孫冶，李新鳴*

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)2014級，遼寧 沈陽 110034；2.基礎醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)2016級；3.基礎醫(yī)學院病原生物學教研室）

益生菌產生抗微生物的物質以清除病原菌，阻斷毒素調控的反應，干擾病原性細菌營養(yǎng)的獲取和粘附，并限制病原菌的存在及致病作用［1］。益生菌可以通過增強細胞免疫和體液免疫來調節(jié)系統(tǒng)免疫應答。益生菌的研究多集中在腸道益生菌上，研究最多的是乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬［2］。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），屬于葡萄球菌屬，是人類化膿性細菌感染中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染［3］。金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院感染的常見病原菌。由于細菌的進化和抗生素的濫用，該菌的耐藥性逐漸增強，特別是甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）。近年來，MRSA感染的耐藥率和多重耐藥菌株不斷增長，導致臨床抗感染治療難度增加［4］。

目前國內外關于益生菌用于金黃色葡萄球菌感染及耐藥菌株僅僅處于嘗試階段。Howard等［5］首次在實驗外科傷口中用植物乳酸桿菌活菌來預防金黃色葡萄球菌的感染。國內有少量報道乳酸桿菌用于抑制金黃色葡萄球菌生長［6-7］。這也說明了通過微生物干預金黃色葡萄球菌感染有著光明的前景，但正式應用臨床還有待更多的實驗。因此，有必要開展益生菌對金黃色葡萄球菌，特別是對耐藥性金黃色葡萄球菌的拮抗作用研究，可以為臨床有效治療金黃色葡萄球菌感染提供新思路，為微生態(tài)制劑療法提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑 金黃色葡萄球菌（CICC 10201）、銅綠假單胞菌（CICC 10003）、大腸埃希菌（CICC 20152）、植物乳酸桿菌（CICC 21790）（對照菌）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。MRS培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（BHI）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購于青島海博生物技術有限公司。TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit購于寶生物工程（大連）有限公司。A549肺癌細胞由病原生物學教研室保存。MTT試劑盒、細胞培養(yǎng)液等試劑購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 益生菌菌株分離培養(yǎng) 吸取100 μl酸奶原液，用BHI培養(yǎng)基稀釋，制備原液、10倍、50倍、100倍稀釋液。取200 μl稀釋液分別涂布在營養(yǎng)瓊脂平板和MRS平板上，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。選擇合適稀釋倍數的菌液平板，分別選取不同形態(tài)特征菌落計數。挑取單個菌落分別分段劃線接種于MRS平板，37℃溫箱中培養(yǎng)24 h。對獲得的不同分離株的純培養(yǎng)物置于含30%甘油的BHI培養(yǎng)基中，-20℃凍存保存。

1.3 初步篩選對金黃色葡萄球菌有抑制作用的益生菌菌株 采用牛津杯法［8］，對分離培養(yǎng)獲得的39株分離株進行致病菌拮抗試驗。金黃色葡萄球菌接種于BHI培養(yǎng)基，放入搖床37℃過夜培養(yǎng)后，用新鮮BHI培養(yǎng)基調節(jié)菌液濃度為108～109個/ml種子液備用。益生菌分離株分別挑取1～2個單菌落放入5 ml BHI培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)18 h，制成種子液。取金黃色葡萄球菌種子液1∶30倍稀釋，稀釋混勻后吸取150 μl加入到營養(yǎng)瓊脂平板上，用涂布棒均勻涂布。將滅菌的牛津杯放置在涂布后的營養(yǎng)平板上，向牛津杯內加入培養(yǎng)的乳酸桿菌種子液200 μl；取等體積BHI培養(yǎng)基作為陰性對照。平板于37℃、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基pH 7.2～7.4、避光培養(yǎng)24 h，測量產生的抑菌環(huán)直徑大小。對有拮抗性的2株分離株（A和B株），按照試劑盒操作說明，提取細菌基因組DNA，PCR擴增16S rDNA片段，由生工生物工程上海（股份）有限公司序列分析，對菌株進行鑒定是否為乳酸桿菌屬。

1.4 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化 實驗搖瓶培養(yǎng)基本條件：溫度35℃，培養(yǎng)時間36 h，接種量25%，培養(yǎng)基初始pH 5.5。根據前期實驗初步測定，培養(yǎng)搖瓶裝液量為50 ml培養(yǎng)液/250 ml培養(yǎng)瓶、轉速180 r/min，菌量達到最高，所以確定其為培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗的搖瓶裝液量、搖床轉速。培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗選擇的因素為拮抗菌株培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量、培養(yǎng)時間。

取抑菌效果強的1株乳酸桿菌（B株）接種于MRS培養(yǎng)基，同前面方法制成種子液。將高壓滅菌的BHI液體培養(yǎng)基分裝到多個三角瓶內，用鹽酸和氫氧化鈉多次少量加入分裝好的BHI液體培養(yǎng)基調節(jié)培養(yǎng)基pH值。分別將溫度（℃）設置為32、35和37℃，初始pH設置為4、5.5和7，接種量設置為10%、25%和50%，培養(yǎng)時間設置為24、36和48 h，進行3水平4因素正交實驗。一共9組實驗，分別按照表1中相應的條件接種種子液。

表1 拮抗菌株培養(yǎng)條件因素水平表

1.5 乳酸桿菌對金黃色葡萄球菌的拮抗作用 利用正交實驗選出的最佳培養(yǎng)條件，培養(yǎng)乳酸桿菌B株，以培養(yǎng)原液作為種子液。同時按前面拮抗實驗方法，制備金黃色葡萄球菌稀釋菌液，并加入到營養(yǎng)平板涂布均勻后，將滅菌后的牛津杯放置營養(yǎng)平板上，分別向牛津杯內加入培養(yǎng)的乳酸桿菌種子液200 μl，檢測益生菌菌株對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用。對照采用BHI培養(yǎng)基、乳酸桿菌A及植物乳酸桿菌，對照菌株種子液制備方法同拮抗初篩實驗。

1.6 細胞毒性試驗 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549肺癌細胞，收集對數期細胞并用培養(yǎng)液調整細胞濃度后分別加入到96孔板，使每孔終體積為 180 μl，5 000個細胞/孔。培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)至細胞貼壁后，再繼續(xù)培養(yǎng)16 h，至細胞單層鋪滿96板孔底，更換為不含血清的培養(yǎng)液。乳酸桿菌B株按照優(yōu)化培養(yǎng)條件制備菌原液，用無血清細胞培養(yǎng)液按照 104、105、106、107、108、109倍比稀釋原液，分別取100 μl不同濃度梯度的益生菌菌液加入單個培養(yǎng)孔，設5個重復孔。培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2溫箱培養(yǎng)16 h。吸取上清液，每孔加入90 μl新鮮培養(yǎng)液，再加入 10 μl MTT 溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS液沖洗2～3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液。每孔加入100 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在490 nm處測量各孔的吸光度值（OD）。實驗中設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、BHI培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

2 結果

2.1 初步篩選出對金黃色葡萄球菌有抑制作用的益生菌菌株 牛津杯法對39株分離株進行拮抗實驗，結果顯示2株分離株有抑制金黃色葡萄球菌生長的作用，其中1株菌株拮抗作用較強。經16S rDNA序列分析均為乳酸桿菌屬。這2株分離益生菌菌株命名為乳酸桿菌A株、乳酸桿菌B株。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌拮抗初篩實驗結果

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 按照設計的正交實驗，對乳酸桿菌B株進行培養(yǎng)優(yōu)化，根據益生菌活菌計數的結果篩取得到最適培養(yǎng)條件為接種量為10%，pH值為5.5，溫度為32℃，培養(yǎng)時間36 h。見表3。

表3 拮抗菌株培養(yǎng)條件正交實驗結果

2.3 乳酸桿菌對金黃色葡萄球菌的拮抗實驗 利用正交實驗選出的最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)乳酸桿菌B株，測定培養(yǎng)細菌原液對金黃色葡萄球菌的抑制作用。拮抗實驗結果顯示優(yōu)化培養(yǎng)后的乳酸桿菌B株仍具備較好的抑菌活性，見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌拮抗實驗結果

2.4 MTT細胞毒性試驗 不同稀釋倍數的乳酸桿菌B優(yōu)化培養(yǎng)原液與A549細胞共同孵育培養(yǎng)后，進行MTT檢測。結果發(fā)現，經One way ANOVA分析與對照組比較，不同濃度條件下乳酸桿菌益生菌株對A549細胞增殖無明顯影響（P＞0.05），見圖2。

圖2 乳酸桿菌B株MTT試驗結果

3 討論

目前耐藥性金黃色葡萄球菌在臨床中發(fā)現病例較多，如甲氧西林敏感性金黃色葡萄球菌對紅霉素類和β-內酰胺類抗菌藥物有較強的耐藥性［9-10］。耐藥性金黃色葡萄球菌致病力更強，而且耐藥機制還未完全明確，為臨床抗生素治療帶來了巨大的困難。因此，如何有效治療金黃色葡萄球菌特別是耐藥菌株引起的感染，是臨床亟待解決的問題。有報道益生菌聯(lián)合應用敏感性抗生素可抑制金黃色葡萄球菌生長［11］。使用合適的益生菌可以減輕炎癥，維持腸道內微生物平衡，因而抑制病原菌增殖，提高機體免疫力［12］。早期使用乳酸桿菌用于呼吸道機械通氣患者可以有效降低肺炎發(fā)生率［13］。

本實驗獲得乳酸桿菌分離株2株，可抑制金黃色葡萄球菌生長。而且實驗中使用的金黃色葡萄球菌菌株是氯霉素、萬古霉素耐藥菌株。乳酸桿菌菌株B經優(yōu)化培養(yǎng)后可在實驗室水平獲得較高活菌量，同時保持較強的抑菌能力。而且優(yōu)化培養(yǎng)的菌株經MTT試驗檢測其對A549細胞增殖的影響，結果顯示不同稀釋梯度的益生菌和對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義，提示從酸奶中分離的乳酸菌菌B株對細胞生長抑制作用。由于其對于細胞無毒性，且來源于乳酸制品，該乳酸桿菌分離株為后續(xù)開展益生菌干預金黃色葡萄球菌感染提供了基礎。使用腸道益生菌預防、治療金黃色葡萄球菌感染是新嘗試，可為解決臨床耐藥性問題提供新途徑。

本研究通過乳酸桿菌分離株對金黃色葡萄球菌的抑制作用，為乳酸桿菌預防、治療金黃色葡萄球菌所致疾病提供了實驗依據。目前治療金黃色葡萄球菌所致的細菌性腹瀉，益生菌聯(lián)合應用抗生素具有良好的治療效果［14］。由于乳酸桿菌屬于人體正常菌群成員，并且乳酸桿菌容易大量培養(yǎng)制備。因此，嘗試使用對乳酸桿菌干預耐藥性金黃色葡萄球菌，具有良好的應用前景。