宋賽賽，賀嬌，程琳

(1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450008；2.陜西省精神衛(wèi)生中心，陜西 西安 710061）

0 引言

外泌體是由機體大多數細胞分泌的。1983 年，Johnstone[1]等首次在網織紅細胞中發(fā)現外泌體的。研究人員在觀察轉鐵蛋白受體的活動時，發(fā)現在網織紅細胞成熟期間，轉鐵蛋白受體被打包，并且被網織紅細胞分泌到胞外小泡中。便認為它是網織紅細胞中的物質被溶酶體破壞后分泌到胞外的垃圾。盡管外泌體發(fā)現的較早，但是由于人們對外泌體的認識還不足，所以在過去的幾十年里，它不受研究人員的關注。據最早報道，部分研究人員認為外泌體主要由免疫細胞（樹突狀細胞、T 細胞、B 細胞巨噬細胞）與腫瘤細胞分泌的。但是人們對外泌體的了解也更深入，更全面，認識到外泌體是包括腫瘤細胞在內的大多數細胞分泌的囊泡小體，血液，尿液等體液均能檢測到外泌體[2]。并發(fā)現其具有一定的生物學活性，它能夠在血管之間自由移動，參加細胞與細胞之間溝通，參與凝血，血管生成等活動。因此，近幾年，研究人員掀起了研究外泌體的熱潮。

1 外泌體的組成

由胞內分泌到胞外的小囊泡，稱為胞外囊泡。囊泡有三大類，根據直徑的大小及形態(tài)學差異，囊泡分三種，直徑由小到大順序依次為：外泌體（40-100 nm)，微泡(100-1000 nm)，凋亡小體(1000-5000 nm)[2]。外泌體直徑與病毒直徑范圍接近，約40-100 nm，密度在1.10-1.18g/mL，使用蔗糖密度梯度離心法提取外泌體時，外泌體可以在密度為1.13-1.19 g/mL 的蔗糖中沉降。電鏡下，外泌體主要為杯形，杯形形狀可能是由于樣品制備中外泌體脫水裂解而形成的。但是在體液中，球形結構為其在體液中的主要形態(tài)。外泌體具有脂質雙分子層結構，其主要由蛋白質，脂質，核酸組成，但是外泌體內部缺乏高爾基體，內質網等活細胞內部存在的細胞器[3]。

1.1 外泌體所含蛋白質

外泌體來源很廣，種類繁多，外泌體的母代細胞可以決定外泌體蛋白的成分及含量。

外泌體中蛋白質分子，一部分為常見蛋白，出現在所有外泌體中。如細胞骨架蛋白（微管蛋白，肌動蛋白），四跨膜蛋白（CD9，CD63），脂質相關蛋白，熱休克蛋白家族（HSP90）等。另一部分蛋白和細胞來源相關，如與內膜系統(tǒng)轉運相關的蛋白ALIX，Tsg101 及ESCRT 家族蛋白等，但外泌體不含有內質網蛋白如鈣聯蛋白Calnexin。因此我們可以使用CD63,CD9 以及鈣聯蛋白衡量外泌體提取方法是否可行，以及判斷使用此方法提取的外泌體純度是否可靠，如提取外泌體后進行蛋白免疫印跡法，若在CD63 或者CD9 等外泌體通用蛋白的相應位置上出現條帶，則證實提取到外泌體，若存在內質網蛋白如鈣聯蛋白，則在其分子量相應的位置上出現條帶，則證實提取的外泌體不純，若無條帶，則證實此種提取方法獲取的外泌體純度高。

此外外泌體細胞來源的蛋白具有相對特異性：如B 淋巴細胞分泌的外泌體表面有MHC-II 類分子；腫瘤細胞來源的外泌體攜帶大量腫瘤抗原[4]。此外，外泌體部分蛋白也可以用于疾病的早期診斷，如胎球蛋白A 可作為急性腎損傷的標志物[5]。再如乳腺癌的外泌體促凋亡蛋白生存素2B（Survivin2B），于乳腺癌早期患者中，表達較多，晚期弱表達甚至不表達，與腫瘤分級呈負相關[6]。因此，外泌體生存素2B 可作為乳腺癌早期診斷的腫瘤標志物。

1.2 外泌體所含脂質

外泌體富含脂質，外泌體膜與細胞膜較接近，富含鞘磷脂，膽固醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇等成分，同時也含有細胞來源的脂質。這些脂質成分，既能維持外泌體脂質雙分子層的結構，促進膜的流動，保護外泌體的內容物miRNA，mRNA，蛋白質等成分的完整，膜上的脂質分子又能作為信號分子，介導細胞間通訊。

1.3 外泌體所含核酸

除蛋白，脂質外，外泌體含有大量的微小RNA（MicroRNA，miRNA） 和 信 使RNA（message RNA，mRNA），核糖體RNA（rRNA），線粒體DNA（mtDNA）等。一直以來，我們多是依靠腫瘤的大小、惡性程度、淋巴結是否轉移、腫瘤分期與分級，來判斷疾病及其預后。如今，外泌體攜帶的核酸可以作為疾病早期診斷的標志物，如食管癌細胞分泌的外泌體miR-21 可以輔助食管癌的診斷[7]，外泌體miR-145 可作為糖尿病腎病的早期診斷，再如胃癌來源的外泌體攜帶的長鏈非編碼RNA(LncRNA)在進行腫瘤診斷上，比CEA，CA199 更有診斷價值。此外，外泌體攜帶的核酸，可以調節(jié)靶細胞基因的調控。如乳腺癌來源的外泌體通過分泌miR-10，下調內皮細胞緊密蛋白的表達，增加血管內皮的通透性，促進乳腺癌的血源性轉移[8]。

2 外泌體之外的幾種胞外囊泡

機體分泌的囊泡不僅有外泌體，還有微泡和凋亡小體。雖然這些小囊泡都是由細胞分泌的，內部均包含從母帶細胞中獲得的胞漿，但是它們之間也有差異。微泡和外泌體主要是由活細胞釋放的，而凋亡小體主要是由凋亡細胞釋放的。在實驗中，由于微泡直徑與外泌體較接近，故兩者容易混淆。

2.1 微泡

一開始，Chargaff[9]認為微泡是無血小板血漿中的沉淀物質，能產生凝血酶。隨后，進一步研究發(fā)現，微泡，主要是由血小板，紅細胞，內皮細胞等胞膜出芽形成的[10]。它具有磷脂雙分子層結構，直徑是在100-1000 nm 之間，與病毒直徑范圍接近，但是在血漿中，可以觀察到，微泡的直徑在100-400納米之間。微泡與外泌體較相似，可以與靶細胞膜直接融合，介導細胞間物質交換與子代與親代之間信息溝通。有研究表明，紅細胞釋放微囊泡的數量容易受到環(huán)境因素的影響，故不能穩(wěn)定釋放。然而，腫瘤細胞不易受到環(huán)境因素影響，穩(wěn)定釋放微囊泡。由于微泡的數量，反映疾病與機體生理狀態(tài)。目前，人們應用流式細胞術來檢測微泡數量，盡管其具有局限性，不能檢測直徑小于200 nm 的囊泡，但它仍是檢測微泡應用最廣泛的技術。

2.2 凋亡小體

凋亡小體，主要是由凋亡細胞釋放的，其直徑為1 ～5 μm。它的特點是凋亡小體磷脂酰絲氨酸外化同時其內部可能含有碎片DNA。凋亡小體的主要功能是能夠向靶細胞轉移基因，從而可以促進吞噬細胞出現T 細胞表位，促進B 淋巴細胞表達細胞自身抗原等[11]。

3 外泌體與細胞間通訊方式

一直以來，我們認為，細胞之間的交流都是通過細胞間接觸或者分子來實現的，如激素，如神經遞質等。但是自從外泌體被發(fā)現以來，人們發(fā)現它也是細胞間信息傳遞的方式之一，它作為細胞間交流的媒介，參與細胞間物質傳遞與信息傳遞。外泌體可以直接或者間接與靶細胞接觸，來進行信號傳遞的。外泌體與細胞信息交流可能通過以下幾種：

3.1 外泌體或其釋放的物質與細胞膜表面配體結合

這是由受體配體作用以及細胞表面的磷脂酰絲氨酸介導的。細胞分泌的外泌體表面的Wnt 蛋白與靶細胞表面受體結合，調節(jié)靶細胞的分化[12]。此外，一部分外泌體可以向細胞外釋放一些因子，如白介素等，這些因子與靶細胞結合，介導一定的生物學功能。腫瘤細胞來源的外泌體可以在在酸性條件向胞外釋放EGF、VEGF 等成分，這些成分作用到血管內皮細胞表面受體導致血管形成，腫瘤生長[13]。

3.2 外泌體被受體細胞內吞

這種方式也是極常見的一種作用方式。細胞吞入的物質為液體與極小的顆粒物質，這屬于胞飲形式。受體細胞的內吞活動依賴于囊泡的大小，而囊泡的大小取決于囊泡所含有的內容物。大的囊泡，則需要通過受體細胞的胞吞進入細胞內。此過程是細胞骨架蛋白（微管蛋白，肌動蛋白）介導的。同時，該過程受到受體細胞吞噬能力的影響。外泌體內吞進入到細胞內，它便與靶細胞器膜融合，向細胞質釋放攜帶的內容物作用于受體細胞，但是最終這些內容物會被受體細胞溶酶體降解。研究發(fā)現，受體細胞內吞外泌體，則可以通過網格蛋白依賴性內吞作用和網格蛋白非依賴性途徑，這兩條途徑得以實現[14-15]。

3.3 外泌體與靶細胞膜融合

在體內微環(huán)境作用下，在Alix 和LBPA 的參與下，外泌體膜與細胞膜融合，外泌體內容物轉移到受體細胞從而進行信號傳導。陳纖[16]研究中，外泌體用紅色FM4-64 熒光染色，H460 細胞用綠色DiO 熒光染色。在DM2000 倒置相差熒光顯微鏡下，觀察到外泌體進入H460 內，并且H460 細胞膜部分顯示橙色（橙色為紅色與綠色的共定位）可判斷，膜融合也是外泌體信息傳遞的一種方式。

4 外泌體的臨床診斷價值

在各種疾病中，外泌體可以輔助臨床用于疾病診斷。Bhagirath[17]等人在研究發(fā)現，外泌體miRNA-1246 可以將正常人群，前列腺增生患者，以及侵襲性前列腺癌患者鑒別來。另有研究人員在研究中發(fā)現，外泌體PSA，PSMA 蛋白，可以用于前列腺癌的診斷[18]。JIA[19]等人表明，外泌體miRNA-21可以輔助臨床用于乳腺癌的診斷。因此，將外泌體用于臨床指日可待。

5 展望

目前，外泌體的研究逐漸深入，人們對外泌體結構，幾種細胞外囊泡的鑒別，以及外泌體如何與靶細胞如何進行通訊等有了較深入研究，但是更深層次的機制仍有待繼續(xù)研究研討。此外，外泌體內容物的發(fā)現包括脂質，核酸，蛋白，均有望應用于臨床，為臨床疾病診斷提供新的方向。