周芳，李清，閆文靖，劉玉平，涂淑敏

(1.徐州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 護(hù)理部，江蘇 徐州 221002；3.北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院 麻醉科，北京 102218)

慢性疼痛是指持續(xù)或間歇性地持續(xù)3個(gè)月以上的疼痛[1]，在普通人群中的發(fā)生率為20%～45%[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，44.2%的妊娠期女性發(fā)生慢性疼痛，其中53.3%的人出現(xiàn)抑郁，30.4%的人出現(xiàn)焦慮癥狀[3]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)孕期慢性疼痛的孕鼠體重增加值顯著低于對(duì)照組孕鼠，且有早產(chǎn)情況，其平均孕期、產(chǎn)仔數(shù)均低于對(duì)照組，但活產(chǎn)率及子代性別比與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[4]。除此以外，慢性疼痛還常伴有認(rèn)知功能的改變，如學(xué)習(xí)、記憶障礙，近80%的慢性疼痛患者認(rèn)為自己記憶力減退[5]。母體妊娠期慢性疼痛是否會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能減退？其子代認(rèn)知功能是否也會(huì)受到影響？至今還未有報(bào)道。

本研究擬通過(guò)構(gòu)建孕期小鼠慢性炎性痛模型，觀測(cè)慢性疼痛對(duì)孕鼠及其子鼠認(rèn)知功能的影響，以揭示孕期慢性疼痛對(duì)母體和子代健康的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

選用未受孕過(guò)的SPF級(jí)昆明小鼠(由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK 2002- 0038)，65～80日齡，雌性，體重33～35 g，同批交配。10～12 h后陰道栓或陰道涂片發(fā)現(xiàn)精蟲(chóng)者定為妊娠第0天。選取30只成功受孕小鼠，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和慢性疼痛組，每組10只。子鼠出生后剔除死胎、發(fā)育畸形、先天殘疾小鼠后對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，用隨機(jī)數(shù)表法分別選出正常組子鼠、假手術(shù)組子鼠和慢性疼痛組子鼠，各10只。所有子代小鼠均按常規(guī)方式飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠慢性疼痛模型的制備 慢性關(guān)節(jié)炎疼痛模型：母鼠交配成功后，在異氟醚麻醉下圍繞左后足的足跖關(guān)節(jié)處選擇兩點(diǎn)，皮內(nèi)注射無(wú)菌完全弗氏佐劑(CFA)100 μl(即500 μg)，誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎性痛。在注射后24 h即出現(xiàn)熱痛覺(jué)閾值的降低并可維持4周以上，持續(xù)整個(gè)孕期(22 d左右)至產(chǎn)后1周。在造模后第1、7、14、21天及產(chǎn)后第7天分別監(jiān)測(cè)模型組小鼠痛閾值，疼痛敏感性降低(熱縮足潛伏期延長(zhǎng))的小鼠追加注射CFA 1次，確保在造模后的28 d內(nèi)慢性疼痛組小鼠維持穩(wěn)定的較低痛閾值(始終處于疼痛狀態(tài))。

假手術(shù)組母鼠用同樣麻醉方式、同樣注射方法、同樣注射部位注入同體積無(wú)菌PBS。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何處理。

1.2.2 孕鼠及其子鼠認(rèn)知行為監(jiān)測(cè) 用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(包括定位航行和空間搜索實(shí)驗(yàn))檢測(cè)母鼠及子鼠認(rèn)知(學(xué)習(xí)和記憶)功能。各組孕鼠在造模后6～12 d測(cè)試，各組子鼠分別于出生后3周(幼年期，可離乳獨(dú)立生活)、6周(青春期)、9周(成年期)測(cè)試。

定位航行實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)學(xué)習(xí)能力。實(shí)驗(yàn)時(shí)平臺(tái)固定在NW象限，位于水面下1 cm。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)6 d，訓(xùn)練第1天(造模后第6天)讓小鼠自由游泳1 min；從第2天(造模后第7天)起，每天每只小鼠測(cè)試4次，每次將小鼠面向池壁輕放入水中。第1次和第4次從目標(biāo)象限對(duì)側(cè)的象限(SE)入水，第2次和第3次隨機(jī)從SW和NE象限入水。小鼠游泳的監(jiān)測(cè)時(shí)間為120 s，計(jì)算機(jī)采集系統(tǒng)自動(dòng)記錄從小鼠入水到找到隱藏平臺(tái)的數(shù)據(jù)和過(guò)程，從小鼠入水到找到平臺(tái)的時(shí)間記為逃避潛伏期。如小鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期計(jì)為60 s。取小鼠4次潛伏期的算術(shù)平均數(shù)作為當(dāng)天的平均逃避潛伏期。每次訓(xùn)練完，用干毛巾將小鼠擦干，以防止低體溫造成的應(yīng)激，讓小鼠休息60 s后開(kāi)始下一次訓(xùn)練。

空間搜索實(shí)驗(yàn)：用于檢測(cè)記憶能力。在定位航行試驗(yàn)結(jié)束后(訓(xùn)練第7天，即造模后第12天)撤除平臺(tái)，從SE象限將小鼠放入水中，記錄小鼠60 s內(nèi)搜尋平臺(tái)的運(yùn)動(dòng)軌跡、在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間、游程占總時(shí)間(時(shí)間比率)和總游程(游程比率)的百分比、平均游速及穿越原平臺(tái)區(qū)的次數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 疼痛模型效果檢測(cè)

采用熱縮足潛伏期檢測(cè)判斷動(dòng)物疼痛閾值變化,結(jié)果見(jiàn)圖1A。由圖1A可見(jiàn)，造模后第1至28天，慢性疼痛組孕鼠在各時(shí)間點(diǎn)熱縮足潛伏期均顯著低于假手術(shù)組孕鼠，提示造模后孕鼠在整個(gè)孕期及產(chǎn)后早期始終處于疼痛狀態(tài)(P<0.001)。慢性疼痛組孕鼠熱縮足潛伏期在各時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示孕鼠整個(gè)孕期疼痛較為穩(wěn)定。以上結(jié)果提示疼痛模型造模成功。

2.2 慢性疼痛對(duì)母鼠認(rèn)知行為的影響

在定位航行實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)第1天的熟悉環(huán)境后，第2天各組孕鼠均能在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，各組平均逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3天至第6天，孕鼠平均逃避潛伏期慢性疼痛組均長(zhǎng)于假手術(shù)組孕鼠(P<0.001)，見(jiàn)圖1B。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，孕鼠穿越平臺(tái)次數(shù)、平均游速、在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間比率及游程比率慢性疼痛組均顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 慢性疼痛對(duì)子鼠認(rèn)知行為的影響

見(jiàn)圖1C及表2。

與假手術(shù)組孕鼠或子鼠比較，aP<0.001，bP<0.01

A.孕鼠熱縮是潛伏期檢測(cè)；B.孕鼠平均逃避潛伏期檢測(cè)；C.子鼠出生后第3周平均逃避潛伏期檢驗(yàn)

圖1各組孕鼠、子鼠行為學(xué)比較

表1各組孕鼠空間搜索能力比較(n=10)

組 別平均游速/cm·s-1穿越平臺(tái)數(shù)/次·(60 s)-1時(shí)間比率/%游程比率/%正常組20.19±0.884.59±1.2342.31±3.8545.13±2.79假手術(shù)組22.20±1.864.71±0.8738.04±4.1642.73±3.12慢性疼痛組19.35±1.47a1.18±1.29b26.36±3.97c24.66±2.21b

與假手術(shù)組比較，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

表2各組子鼠出生后3周空間搜索能力比較(n=10)

組 別平均游速/cm·s-1穿越平臺(tái)數(shù)/次·(60 s)-1時(shí)間比率/%游程比率/%正常組19.33±1.674.32±1.5739.47±4.1743.29±3.54假手術(shù)組20.79±1.624.26±1.2140.33±4.2843.87±3.58慢性疼痛組19.52±1.333.19±1.53a39.31±3.8642.15±3.16

與假手術(shù)組比較，aP<0.05

由圖1C可見(jiàn),在子鼠出生的第3周期間，慢性疼痛組子鼠平均逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于假手術(shù)組子鼠(P<0.01)。在出生后第6周和第9周，兩組子鼠平均逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，出生后第3周慢性疼痛組子鼠穿越平臺(tái)次數(shù)少于假手術(shù)組子鼠(P<0.05)，平均游速、在原平臺(tái)象限停留的時(shí)間比率和游程比率與假手術(shù)組子鼠比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。至其出生后第6周和第9周，各組子鼠在定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

3 討 論

國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)將疼痛定義為一種與組織損傷或潛在組織損傷相關(guān)的感覺(jué)、情感、認(rèn)知和社會(huì)維度的痛苦體驗(yàn)[6]。與疼痛的感覺(jué)相比，有關(guān)疼痛狀態(tài)下認(rèn)知功能的減退一直沒(méi)有得到足夠的關(guān)注，這也是臨床治療中常被忽視的部分。本研究結(jié)果顯示，孕期慢性疼痛可導(dǎo)致孕鼠認(rèn)知能力下降。有研究指出，認(rèn)知能力減退主要與患者慢性疼痛強(qiáng)度、負(fù)性情緒和鎮(zhèn)痛藥的使用等有關(guān)[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是人類(lèi)孕婦還是懷孕小鼠，如罹患慢性疼痛均會(huì)出現(xiàn)抑郁[3,8]。因此我們推測(cè)，本研究中母鼠認(rèn)知能力的下降與其慢性疼痛的持續(xù)存在有關(guān)，也可能與慢性疼痛導(dǎo)致的抑郁情緒有關(guān)。

關(guān)于慢性疼痛導(dǎo)致認(rèn)知障礙的機(jī)制，Van Ryckeghem提出，學(xué)習(xí)記憶、抑郁和疼痛在腦內(nèi)調(diào)控過(guò)程中是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，當(dāng)慢性疼痛引發(fā)負(fù)性情緒出現(xiàn)時(shí)，涉及信息加工整合的記憶功能就會(huì)受影響[9]。已有研究表明，疼痛與記憶、抑郁存在共同的中樞神經(jīng)通路，與疼痛有關(guān)的中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)如前額葉皮質(zhì)、杏仁核、丘腦、海馬等腦區(qū)，同時(shí)也是記憶神經(jīng)通路的一部分，在焦慮抑郁的發(fā)生過(guò)程中也起到一定的作用[10]。此外，疼痛、抑郁和記憶所涉及的邊緣神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)也存在部分重疊現(xiàn)象，神經(jīng)影像學(xué)研究證實(shí)，這些區(qū)域在疼痛、抑郁和記憶的加工過(guò)程中被激活[11]。因此，未來(lái)關(guān)于慢性疼痛導(dǎo)致負(fù)性情緒、認(rèn)知障礙機(jī)制的研究，從神經(jīng)環(huán)路機(jī)制著手可能是比較合理的做法。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在子鼠出生后3周的定位航行實(shí)驗(yàn)中，慢性疼痛組子鼠的學(xué)習(xí)能力顯著差于假手術(shù)組子鼠，而在其出生后6、9周的定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組子鼠學(xué)習(xí)能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示子鼠在出生后早期有一定程度的學(xué)習(xí)障礙，但隨著生長(zhǎng)發(fā)育逐漸成熟，其學(xué)習(xí)能力可恢復(fù)至與正常小鼠無(wú)異。我們?cè)?jīng)報(bào)道孕期慢性疼痛可導(dǎo)致其新生鼠的尾長(zhǎng)、體重及行為表征(平面翻正達(dá)標(biāo)率、爬行達(dá)標(biāo)率)顯著差于正常組新生鼠[4]。但慢性疼痛組子鼠出生后第3周在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，其平均游速與假手術(shù)組子鼠相比無(wú)差異，說(shuō)明其水中運(yùn)動(dòng)能力與正常小鼠相比無(wú)顯著性差異，這提示胎內(nèi)發(fā)育不良在成長(zhǎng)過(guò)程中有逐漸改善的可能。

水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物認(rèn)知功能檢測(cè)具有良好的可信性[12]，在較多慢性疼痛研究中亦有應(yīng)用[13]。本研究中慢性疼痛模型是小鼠左后足足跖關(guān)節(jié)炎癥模型，肢體疼痛對(duì)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)可能會(huì)有一定的影響。但本研究定位航行實(shí)驗(yàn)測(cè)試的第1天，各組孕鼠均能在60 s內(nèi)找到平臺(tái)，各組平均逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)條件下，后足痛對(duì)孕鼠在水中運(yùn)動(dòng)能力的影響并沒(méi)有顯著干擾水迷宮對(duì)其認(rèn)知能力測(cè)試的可信性。但是研究者應(yīng)尋求更加科學(xué)合理的認(rèn)知檢測(cè)方法，最大程度地避免運(yùn)動(dòng)能力受限有可能對(duì)認(rèn)知功能檢測(cè)帶來(lái)的干擾。

綜上所述，孕期慢性疼痛會(huì)導(dǎo)致母體認(rèn)知能力的下降，也可能會(huì)影響其子代早期的腦認(rèn)知功能。人們對(duì)于慢性疼痛的研究應(yīng)關(guān)注到孕婦這一特殊人群，對(duì)于慢性疼痛機(jī)制的研究不應(yīng)局限于疼痛本身，對(duì)慢性疼痛引發(fā)的抑郁焦慮、認(rèn)知功能下降的發(fā)生機(jī)制也應(yīng)當(dāng)予以足夠的重視。