李凱，王元林，徐元高，儲鑄鋼，徐述雄，石華

(貴州省人民醫(yī)院 泌尿外科,貴州 貴陽 550002)

膀胱癌是常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，生物學行為常表現為多發(fā)、侵襲和復發(fā)等，給治療和預防工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)[1- 2]。目前研究顯示，在膀胱移行細胞癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中，常伴有細胞凋亡和增殖過程的異常，其中以調節(jié)細胞凋亡的p53蛋白同源物基因PTEN異常表達最為突出[3- 4]。作者將膀胱移行細胞癌患者與良性前列腺增生患者的膀胱組織作對比，探究了PTEN甲基化及p53異常表達與膀胱移行細胞癌發(fā)生的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2016年1月至2017年12月收治的71例膀胱移行細胞癌患者作為觀察組，患者年齡48～68歲，平均(58.35±8.24)歲；單發(fā)性癌灶49例，多發(fā)癌灶22例。臨床分期：非肌層浸潤性48例，肌層浸潤性23例；病理分級：G1、G2期52例，G3期19例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移46例。同時選取正常膀胱組織標本(來自良性前列腺增生患者)71例作為對照組，患者年齡47～69歲，平均(57.27±8.61)歲。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PTEN甲基化的檢測 使用德國Qiagen公司QIAamp DNA FFPE組織試劑盒提取觀察組和對照組膀胱組織的DNA，置于-20 ℃保存。應用亞硫酸氫鹽對甲基化和非甲基化的DNA標準品進行修飾，并作為甲基化和非甲基化的對照。對兩組患者膀胱組織的DNA進行亞硫酸氫鹽修飾并提純，置于-20 ℃保存。根據相關文獻[5]，選取外顯子556- 971bp高CpG區(qū)域，即PTEN基因啟動子高度甲基化區(qū)域進行甲基化狀態(tài)的研究。對上述經亞硫酸氫鹽修飾處理后的組織進行測序。測序的引物設計如下：PTEN基因甲基化測序的PCR正向排序為：5′- TATAGATTTGGGGGAAGGGGGAATT- 3′,反向排序為5′- CCCTTACCTCTACCCCTAAATTTC- 3′，引物加生物素修飾。按照試劑盒說明書進行擴增。PCR反應總體系：H2O 34.8 μl、5倍緩沖液GC 10 μl、上下游引物各1 μl、全基因組DNA樣本2 μl、Taq酶0.2 μl，共48 μl。循環(huán)條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，最適溫度下退火30 s，72 ℃延伸10 min，總計35個循環(huán)，最后在72 ℃的條件下延伸10 min。再將產物進行焦磷酸法測序：在96孔PCR反應板中加入反應結合珠2 μl、結合緩沖液38 μl以及PCR產物40 μl，室溫混勻。將結合珠和PCR產物應用真空泵吸出，并依次浸入70%乙醇溶液、0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液和沖洗液中，每次5 s。停用真空泵后取下結合珠與PCR產物，并一同置入40 μl退火緩沖液中，在85 ℃下變性處理2 min，然后將其冷卻至室溫進行雜交。在儀器中加入底物混合物、反應所需酶以及脫氧核苷酸；將試劑艙和96孔反應板放入焦磷酸測序檢測儀中檢測，并應用Pyro Q- CpG軟件對甲基化位點進行檢測。本次實驗中檢測甲基化率的位點為連續(xù)的胸腺嘌呤和胞嘧啶片段，而片段中共有4個胸腺嘌呤和胞嘧啶連續(xù)片段，因此，樣本中4個胸腺嘌呤和胞嘧啶位點的甲基化率總和即為樣本中PTEN基因啟動子區(qū)甲基化率。

1.2.2 p53蛋白表達的檢測 將樣本5 μm厚切片，行HE染色和免疫組化染色。免疫組化法應用p53鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術公司提供)。操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3 判定標準

p53蛋白染色陽性為黃色或棕黃色染色。在400倍的顯微鏡下觀察3個高倍視野，每個視野中計數100個細胞，并計數平均陽性細胞數及比率。陽性細胞比率<10%為陰性，10%～25%為弱陽性，26%～50%為陽性，≥51%為強陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 兩組PTEN基因甲基化的情況

PTEN基因甲基化率觀察組為(21.73±7.92)%，顯著高于對照組的(7.54±2.35)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 膀胱癌組織PTEN基因啟動子甲基化率與臨床病理學的關系

見表1。

表1膀胱癌組織PTEN基因啟動子甲基化率與臨床病理學的關系

臨床病理資料nPTEN基因甲基化率/%t值P值年齡 ≥50歲4920.83±6.580.497>0.05 <50歲2221.06±7.02腫瘤長徑 ≤5 cm6019.96±8.331.687>0.05 >5 cm1121.87±8.581.687>0.05組織學分級 0、Ⅰ級4817.62±5.723.112<0.05 Ⅱ、Ⅲ級2322.88±4.97淋巴結轉移 陰性4115.74±5.337.064<0.05 陽性3124.35±5.61

表1顯示，組織學分級為Ⅱ、Ⅲ級和淋巴結轉移陽性的患者，組織PTEN基因啟動子甲基化率顯著高于組織學為0、1級和淋巴結轉移陰性的患者，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而年齡、腫瘤長徑與PTEN基因啟動子甲基化率無關。

2.3 兩組患者膀胱組織中p53蛋白表達水平比較

見表2。

表2兩組患者膀胱組織中p53蛋白水平比較

組 別np53蛋白表達情況弱陽性陽性強陽性陰性p53表達陽性率/%對照組714316311.27觀察組712128101283.10χ2值73.501P值<0.05

表2顯示，p53蛋白表達陽性率觀察組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 膀胱癌組織p53蛋白表達與臨床病理學關系

見表3。

表3膀胱癌組織p53蛋白表達與臨床病理學關系

臨床病理資料np53蛋白陽性/例t值P值年齡 ≥50歲4945(91.84%)8.597<0.05 <50歲2214(63.64%)腫瘤長徑 ≤5 cm4332(74.42%)5.849<0.05 >5 cm2827(96.43%)組織學分級 0、Ⅰ級3828(73.68%)5.159<0.05 Ⅱ、Ⅲ級3331(93.94%)淋巴結轉移 陰性4030(75.00%)4.278<0.05 陽性3129(93.55%)

表3顯示，年齡、腫瘤長徑及組織學分級、淋巴結轉移均與p53蛋白表達有關。

3 討 論

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率居我國泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，在全球范圍內占成年惡性腫瘤的8%，其中膀胱移行細胞癌是最常見的病理類型(占90%)[6- 7]。膀胱癌的發(fā)病機制目前仍不明確，目前學術界的主要觀點是膀胱癌患者存在原癌基因與抑癌基因尤其是抑癌基因的異常表達。焦磷酸測序方法可以從分子水平上對于DNA序列和甲基化水平進行分析。該方法不但所需樣本少，而且具有較好的檢測精度。PTEN是10q23染色體上的磷酸酶基因，與張力蛋白同源[8]。PTEN基因的異常表達可導致Cowden綜合征、宮頸癌等一系列腫瘤的產生。PTEN基因啟動子出現甲基化，激活了PIP3通路，使得細胞的凋亡過程受抑，或進入分裂周期進程，造成細胞分裂增殖的失控，引發(fā)癌癥。對于PTEN在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，目前學術界并無統(tǒng)一結論。本研究發(fā)現，膀胱癌組織中的PTEN基因甲基化率顯著高于對照組(P<0.05)，提示PTEN基因甲基化與膀胱癌的發(fā)生密切相關；組織學分級較高、淋巴結轉移為陽性的患者，PTEN基因的甲基化率也明顯升高，說明其與膀胱癌的發(fā)展有關。

與PTEN基因相似，p53蛋白也是腫瘤學研究的熱點。p53蛋白被認為是一個具有多種功能的轉錄因子。p53基因轉錄形成2.5 kb的mRNA并最終翻譯為393個氨基酸的p53蛋白，是目前被認為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展最為密切的蛋白。最初認為p53基因是一種癌基因，后研究發(fā)現p53基因有兩種——野生型和突變型的p53，前者可以抑制過度的細胞增殖從而抑制癌癥，而后者則無這一作用，此時細胞的增殖不受抑制，大大提高了癌癥發(fā)生的可能性[9]。本研究所檢測的是半衰期較長的突變型p53，而其在膀胱移行細胞癌組織中的表達顯著高于正常的膀胱組織(P<0.05)。提示p53基因的異常表達在膀胱移行細胞癌的發(fā)生、進展及轉移中均有重要作用，給膀胱移行細胞癌的診斷與治療提供了新思路，使靶向治療成為可能[10]。

綜上所述，PTEN基因的甲基化和p53蛋白的表達在膀胱移行細胞癌患者中均呈明顯的上升趨勢，關于兩者之間是否存在某種相關性仍需進一步探究。深入探討膀胱癌可能發(fā)生的分子結構異常，對于闡明膀胱癌的發(fā)生機制及藥物可能的作用機理意義深遠。