王宏茂，邱彬，鄧然，王超，雍偉東，石琳*

（1.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院，心血管內(nèi)科，北京 100020；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，基因與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

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胚胎干細(xì)胞對(duì)孕鼠缺血受損心肌的修復(fù)作用

王宏茂1，邱彬2，鄧然2，王超2，雍偉東2，石琳1*

（1.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院，心血管內(nèi)科，北京 100020；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院&中國(guó)醫(yī)學(xué)科院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，基因與發(fā)育實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

【摘要】目的 探討胎鼠胚胎干細(xì)胞是否可通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入懷孕母體，并對(duì)孕鼠缺血損傷的心肌組織進(jìn)行修復(fù)。方法 將24只6～8周齡C57雌性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=8）、手術(shù)+受孕組（n=8）和手術(shù)組+未受孕組（n=8），通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法制作心肌梗死模型，并將手術(shù)后受孕組小鼠與e-GFP轉(zhuǎn)基因雄鼠進(jìn)行雜交。三組小鼠分別在術(shù)前、術(shù)后和孕產(chǎn)后進(jìn)行心電圖和超聲心動(dòng)檢測(cè)，比較其心功能的變化；通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，觀察各組小鼠心肌結(jié)構(gòu)的變化，并檢測(cè)孕鼠心肌是否表達(dá)熒光蛋白，以確定是否存在胚胎來(lái)源的Gfp陽(yáng)性細(xì)胞。同時(shí)通過(guò)普通半定量PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)孕鼠血液DNA中是否存在Gfp基因。結(jié)果 手術(shù)+受孕組及手術(shù)+未受孕組小鼠術(shù)后心電圖結(jié)果可見(jiàn)其ST段具有顯著抬高，提示出現(xiàn)明顯的心肌缺血表現(xiàn)，而手術(shù)+受孕組小鼠產(chǎn)后心電圖結(jié)果提示其缺血癥狀較孕前減輕。超聲結(jié)果也證實(shí)手術(shù)后小鼠均出現(xiàn)明顯的心肌梗死表現(xiàn)，手術(shù)+受孕組小鼠產(chǎn)后心腔結(jié)構(gòu)雖較孕前未見(jiàn)明顯改變，各項(xiàng)心功能指標(biāo)較假手術(shù)組減低，但與手術(shù)+未受孕組相比，心功能指標(biāo)明顯升高（P＜0.05）。此外，通過(guò)免疫組化染色和PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)手術(shù)+受孕組心肌梗死區(qū)域具有GFP陽(yáng)性表達(dá)，而其他兩組均為GFP陰性。結(jié)論 胎鼠的胚胎干細(xì)胞可透過(guò)胎盤屏障，隨血液遷移至母孕鼠體內(nèi)，并對(duì)缺血損傷的心肌進(jìn)行修復(fù)。

【關(guān)鍵詞】胚胎干細(xì)胞；綠色熒光蛋白；心肌缺血；心肌損傷修復(fù)；小鼠；孕鼠

研究表明，不僅在妊娠期，甚至在胎兒出生后幾十年內(nèi)仍可在母體的外周血及器官內(nèi)檢測(cè)到胎兒的相關(guān)細(xì)胞［1］。這是由于在妊娠期時(shí)，母體與胎兒的有核血細(xì)胞之間存在雙向運(yùn)輸，從而形成了胚胎期細(xì)胞的微嵌合體（microchimerism，MC）。微嵌合體屬于嵌合體的一種，當(dāng)供/受體細(xì)胞比例＞1%時(shí)，稱為嵌合體；而＜1%時(shí)，則被稱為微嵌合體，是指有一小部分來(lái)自于另一個(gè)個(gè)體、遺傳上與宿主不同的細(xì)胞在宿主的身體內(nèi)殘留，即在母體身上發(fā)現(xiàn)子代個(gè)體的DNA或細(xì)胞的現(xiàn)象。這種微嵌合體可能通過(guò)修改母體免疫識(shí)別或者免疫耐受機(jī)制而長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于母體，而這種轉(zhuǎn)移至母體的可穩(wěn)定存在的微嵌合體（胚胎干細(xì)胞），可能通過(guò)發(fā)揮其修復(fù)和再生作用，進(jìn)而影響和參與多種疾病的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸［2］。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是早期胚胎或原始性腺中分離出來(lái)的一類細(xì)胞，具有無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性。ESCs具有發(fā)育的全能性，可分化為外胚層、中胚層和內(nèi)胚層的各種細(xì)胞，具有分化成為機(jī)體內(nèi)任一組織和器官的能力，因而稱之為“萬(wàn)能”細(xì)胞。近年來(lái)的研究表明，ESCs在臨床醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的有著十分重要的意義，特別是在修復(fù)壞死心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜退化、腦缺血及神經(jīng)退行性病變等方面［3-7］。國(guó)外研究表明胚胎干細(xì)胞能夠通過(guò)胎盤屏障，進(jìn)入母體血液循環(huán)并可發(fā)生定植，但是否可通過(guò)此方式修復(fù)母體缺血受損的心肌組織，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用小鼠心肌梗死模型和e-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，探討胎鼠胚胎干細(xì)胞是否可以遷移至母孕鼠的缺血心肌組織，并初步探索胎兒胚胎干細(xì)胞是否對(duì)母體孕鼠器官的急性損傷具有修復(fù)作用。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級(jí)C57雌性小鼠24只，體重20～25 g，6～8周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司【SCXK（京）2014-0004】，隨機(jī)分為3組（每組8只），分別為假手術(shù)組、手術(shù)+受孕組和手術(shù)組+未受孕組。清潔級(jí)GFP轉(zhuǎn)基因雄性小鼠8只，8周齡，為本實(shí)驗(yàn)室保存。以上動(dòng)物均飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所清潔級(jí)小鼠房?jī)?nèi)【SYXK（京）2011-0022】。

1.2 材料

戊巴比妥鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó)）、阿莫西林舒巴坦（哈藥集團(tuán)，中國(guó)）、呼吸機(jī)（Kent Scientific，美國(guó)）、MP150型多導(dǎo)電生理記錄儀（16通道）（Biopac，美國(guó)）、高分辨小動(dòng)物超聲系統(tǒng)（Visualsonic Vevo 770，美國(guó)）、解剖鏡（YZ20T9，中國(guó)）、冷光源（北京玻璃研究院，中國(guó)）、GFP抗體（Abcam，美國(guó)）、山羊抗兔二抗（中杉金橋，中國(guó)）、DAB顯色液（中杉金橋，中國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠心肌梗塞模型制備及分組

根據(jù)小鼠短期缺血-再灌注模型制備［8-11］的方法加以改進(jìn)，具體如下：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.024 mL/10 g）麻醉動(dòng)物，脫去頸部及前胸部皮膚后備皮、消毒，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。通過(guò)氣管插管術(shù)連接呼吸機(jī)，設(shè)定潮氣量3 mL、正壓通氣30 cm H2O、呼吸頻率120次/分。待小鼠呼吸節(jié)律與呼吸機(jī)一致時(shí)，即氣管插管成功。插管成功后，對(duì)小鼠進(jìn)行開(kāi)胸手術(shù)。先于小鼠在左胸骨外1～2cm縱向剪開(kāi)皮膚，開(kāi)口長(zhǎng)度1～2 cm，然后順肋間隙方向于胸骨左旁第3肋間逐層鈍性分離肌肉及胸膜，于2～3肋骨間撐開(kāi)進(jìn)胸，向右上方推開(kāi)胸腺，可暴露心臟及大血管根部，切開(kāi)心包，可在左心耳下緣處看到左冠狀動(dòng)脈前降支起始部，用6-0 prolene線縫針以起始部至心尖中上1/3處進(jìn)針，進(jìn)針深度控制在0.1 cm，寬度控制在0.1～0.2 cm?；丶{心臟入胸廓，待小鼠10次心動(dòng)周期后，收線打結(jié)。觀察數(shù)分鐘后，徹底止血并逐層關(guān)胸。關(guān)胸過(guò)程中可稍用力擠壓胸腔，盡量排盡胸腔積氣。5 min后待小鼠狀態(tài)穩(wěn)定，恢復(fù)小鼠自主呼吸，拔出小鼠氣管內(nèi)插管，將小鼠放至日光燈下復(fù)溫10 min。以上手術(shù)操作均在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，術(shù)后腹腔給予阿莫西林舒巴坦（3 mg/10 g）以預(yù)防感染。假手術(shù)組小鼠開(kāi)胸后，僅在相同部位縫線但不結(jié)扎。雌鼠于術(shù)后1周進(jìn)行心電圖及超聲心動(dòng)檢測(cè)，術(shù)后2周可與雄鼠合籠。

1.3.2 交配受孕

手術(shù)+受孕組雌鼠于手術(shù)穩(wěn)定2周后開(kāi)始與GFP轉(zhuǎn)基因雄性小鼠以1∶1進(jìn)行合籠。每天下午5點(diǎn)合籠，次日上午8點(diǎn)檢查是否形成陰道栓，以檢查到陰道栓時(shí)記為0.5 d。實(shí)驗(yàn)中合籠2 d時(shí)，所有受孕組小鼠（各8只）均見(jiàn)栓，妊娠周期為18～20 d。

1.3.3 心電監(jiān)測(cè)

各組小鼠（各8只）于手術(shù)后1周及孕鼠產(chǎn)后（手術(shù)后32～35 d）各組小鼠分別使用MP150型多導(dǎo)電生理記錄儀（16通道）（Biopac，美國(guó)）進(jìn)行小鼠心電監(jiān)測(cè)，了解術(shù)后及產(chǎn)后心電圖變化。腹腔注射0.6%戊巴比妥鈉（0.08 mL/10 g）麻醉小鼠，以II導(dǎo)聯(lián)連接小鼠肢體，記錄各組心電圖。

1.3.4 超聲心動(dòng)檢測(cè)

各組小鼠（各8只）于手術(shù)后1周及孕鼠產(chǎn)后（手術(shù)后32～35 d）進(jìn)行超聲心動(dòng)檢測(cè)，以比較小鼠手術(shù)后和孕后不同時(shí)期心臟結(jié)構(gòu)的變化。腹腔注射三溴乙醇（1.25%，0.2 mL/10 g）麻醉小鼠，胸部脫毛后以仰臥位固定于超聲架上，使用高分辨小動(dòng)物超聲系統(tǒng)（Visualsonic Vevo 770，美國(guó)）對(duì)小鼠心臟進(jìn)行超聲檢測(cè)，記錄圖像及心功能數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.3.5 心臟取材

各組小鼠（各8只）于手術(shù)1月后（約為32～35 d）腹腔注射0.6%戊巴比妥鈉（0.08 mL/10 g）麻醉，打開(kāi)腹腔，從腹腔靜脈內(nèi)取血0.3 mL。之后打開(kāi)胸腔，取出心臟，在PBS緩沖液中清洗3次。心臟修剪整齊以O(shè)CT包埋后放入-80℃保存。

1.3.6 血清DNA提取及PCR擴(kuò)增

各組小鼠（各8只）血液以鹽析法提取 DNA后，通過(guò)PCR擴(kuò)增反應(yīng)及水平凝膠電泳檢測(cè)Gfp基因表達(dá)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸10 min。各組小鼠Gfp表達(dá)以Gapdh進(jìn)行校正。Gfp正向引物：5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3'；Gfp反向引物：5'-TCAAAGATCTACCATGTACAGCTCGT-3'；Gapdh正向引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'；Gapdh反向引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。

1.3.7 冰凍切片及免疫組織化學(xué)染色

從-80℃取出OCT包埋的各組心臟組織（每組8只），于-20℃復(fù)溫1 h后，使用冰凍切片機(jī)（Leica，德國(guó)）以5 μm為厚度進(jìn)行冰凍切片。切片以病變部位為主，縱切并盡量包含四腔心。切片后于-20℃保存。

切片從-20℃取出后于4℃回溫10 min，室溫回溫20 min后，以PBS沖洗3次。切片經(jīng)微波修復(fù)（檸檬酸鈉）后，使用3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。切片經(jīng)山羊血清封閉后，一抗（1∶200）孵育4℃過(guò)夜。次日以PBS洗去未結(jié)合一抗，并按照實(shí)驗(yàn)步驟孵育二抗。應(yīng)用DAB溶液顯色后，以蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水封片，室溫放置1 d后，收片保存。應(yīng)用正置顯微鏡采集圖片（Leica，德國(guó)）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1 肉眼大體形態(tài)觀察

手術(shù)1月后手術(shù)+受孕組及手術(shù)+未受孕組小鼠均可觀察到左室前外側(cè)壁可見(jiàn)橢圓形、不規(guī)則形心臟變白區(qū)，約占左室面積1/3～1/2，變白區(qū)心肌活動(dòng)減弱或消失，甚至反常運(yùn)動(dòng)；同時(shí)可見(jiàn)左室前外側(cè)壁明顯變薄，心肌橫截面約占左室周徑1/3的左室前外側(cè)壁明顯變薄。由此可證實(shí)手術(shù)模型建立成功，手術(shù)后各組均出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的心肌梗死形態(tài)。

2.2 受孕明顯改善心梗誘導(dǎo)的小鼠心電圖改變

心電圖為檢測(cè)心肌梗死手術(shù)模型制作成功與否的金標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)中手術(shù)后雌鼠心電圖呈現(xiàn)特殊的ST段抬高的心肌缺血或梗死表現(xiàn)，說(shuō)明心肌梗死模型制作成功（圖1 C和E）。通過(guò)建立心肌梗死模型，觀察術(shù)前及術(shù)后心電圖變化情況，研究手術(shù)+受孕組胚胎干細(xì)胞遷徙受損心肌后，在心電圖方面改善的情況。圖1A和B為正常組心電圖；圖1 C和D分別為手術(shù)+未受孕組同只母孕鼠在手術(shù)后1周和產(chǎn)后1月的心電圖，前者可見(jiàn)到ST段弓背向上抬高，為心肌梗死急性期表現(xiàn)；后者可看到ST段較前稍有下降，但無(wú)明顯恢復(fù)的變化。圖1 E和F為手術(shù)+受孕組同只母鼠術(shù)后1周和1月心電圖，前者表現(xiàn)為ST段高聳，為心肌梗死急性期表現(xiàn)；后者表現(xiàn)為ST段輕度倒置，表現(xiàn)為心肌梗死已經(jīng)進(jìn)入慢性期，其恢復(fù)水平較手術(shù)+未受孕組好。

圖1　各組雌鼠心電圖的改變情況Note.A.ECG of a mouse of the sham group at 1 week after operation；B.ECG of a mouse of the sham group at 1 month after operation；C.ECG of a mouse of the surgery+no pregnancy group at 1 week after operation；D. ECG of a mouse of the surgery+no pregnancy group at 1 month after operation；E.ECG of a mouse of the surgery +pregnancy group at 1 week after operation；F.ECG of a mouse of the surgery+pregnancy group at 1 month after operation.n=8.Fig.1 Changes of electrocardiogram（ECG）in each group

2.3 受孕明顯改善心梗誘導(dǎo)的小鼠心臟結(jié)構(gòu)改變

超聲心動(dòng)圖為檢測(cè)孕鼠術(shù)后遠(yuǎn)期發(fā)生心肌重構(gòu)后的結(jié)構(gòu)和功能，觀察孕鼠術(shù)后1個(gè)月心臟結(jié)構(gòu)變化，及心功能變化情況。心肌梗死亞急性期或慢性期出現(xiàn)心室重構(gòu)，心功能降低，故超聲心動(dòng)圖既可以評(píng)價(jià)心肌結(jié)構(gòu)變化，也可作為評(píng)判心梗模型建立成功與否的標(biāo)準(zhǔn)之一。圖2分別為假手術(shù)組、手術(shù)+受孕組、手術(shù)+未受孕組在相同條件下飼養(yǎng)1月后的超聲心動(dòng)圖。由結(jié)果可見(jiàn)，假手術(shù)組雌鼠手術(shù)后1月心臟結(jié)構(gòu)完整，心功能大致正常（圖2A）。手術(shù)+未受孕組雌鼠超聲圖像，可見(jiàn)其心臟心腔明顯擴(kuò)大，心尖鈍圓明顯，前壁變薄，心肌內(nèi)出現(xiàn)梗死灶，心室重構(gòu)明顯，甚至出現(xiàn)室壁瘤，而心功能明顯減低（圖2 B）。從手術(shù)+受孕組超聲圖像中可見(jiàn)心臟心腔擴(kuò)大，前壁變薄，心肌梗死灶明顯，已經(jīng)發(fā)生心室重構(gòu)，心功能減低（圖2 C）。但通過(guò)圖2 B和圖2 C的比較可見(jiàn)，前者心腔擴(kuò)大更為明顯，心臟前壁更薄，心尖更鈍圓，說(shuō)明心肌梗死程度更重，也說(shuō)明心肌梗死已由急性期演變到慢性期；前者即手術(shù)+受孕組心肌梗死損傷情況較后者輕，提示可能是由于胎鼠胚胎干細(xì)胞遷移至母鼠心臟損傷處對(duì)梗死心肌的修復(fù)作用所致。

通過(guò)建立心肌梗死模型，觀察各組小鼠超聲心動(dòng)圖及心功能的改善情況，特別是手術(shù)+受孕組，根據(jù)比較其心功能改善情況，來(lái)評(píng)價(jià)受孕對(duì)心肌梗死后心功能的改善作用。如表1所示假手術(shù)組、手術(shù)+受孕組和手術(shù)+未受孕組小鼠，于手術(shù)1月后（手術(shù)+受孕組小鼠均已進(jìn)入孕產(chǎn)期）以超聲檢測(cè)各組小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)（EF/%）、左室內(nèi)徑（收縮期）（LVID/d）、左室內(nèi)徑（舒張期）（LVID/s）。結(jié)果顯示手術(shù) +受孕組 EF%較假手術(shù)組減低（P＜0.05），而較手術(shù)+未受孕組升高（P＜0.05）；手術(shù)+受孕組LVID/d較假手術(shù)組升高（P＜0.05），而較手術(shù)+未受孕組降低（P＜0.05）；手術(shù)+受孕組LVID（s）較假手術(shù)組升高（P＜0.05），而較手術(shù)+未受孕組降低（P＜0.05）。

圖2　各組小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)Note.A.Echocardiography of a mouse of the sham group；B.Echocardiography of a mouse of the surgery without pregnancy group；C.Echocardiography of a mouse of the surgery+pregnancy group.n=8.Fig.2 Changes of the cardiac function in mice of each group detected by echocardiography taken at one month after operation

表1　各組小鼠心臟超聲心動(dòng)參數(shù)（n=8，±s）Tab.1 The echocardiographic parameters in the mice of each group

表1　各組小鼠心臟超聲心動(dòng)參數(shù)（n=8，±s）Tab.1 The echocardiographic parameters in the mice of each group

注：*，手術(shù)+受孕組與假手術(shù)組相比差異有顯著性；#，手術(shù)+未受孕組與手術(shù)組相比差異有顯著性（P＜0.05）。Note.*，significant difference when the surgery+pregnancy group was compared with sham group；#，significant difference when the surgery+pregnancy group compared with the surgery without pregnancy group（ANOVA on ranks，P＜0.05）.

組別Groups　EF/%　LVID/d　LVID/s假手術(shù)組Sham group　0.704±0.043　3.264±0.188　2.204±0.175手術(shù)+受孕組Surgery+pregnancy group　0.501±0.01*　3.91±0.216*　3.000±0.338*手術(shù)組+未受孕組Surgery without pregnancy group　0.315±0.089#　4.714±0.635#　3.938±0.815#

2.4 孕鼠血液中可檢測(cè)到GFP基因

各組小鼠（各8只）于手術(shù)1月后提取血液DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增和水平凝膠電泳，檢測(cè)是否存在GFP基因，以檢驗(yàn)孕鼠血液循環(huán)中是否含有來(lái)源于胚胎的GFP基因。通過(guò)鹽析法提取手術(shù)后一月雌孕鼠血液中DNA，經(jīng)GFP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行水平凝膠電泳檢測(cè)。如圖3所示，手術(shù)+受孕組雌鼠血液中存在GFP基因，而假手術(shù)組和手術(shù)+未受孕組雌鼠血液中均未檢測(cè)到GFP基因。因此提示胚胎細(xì)胞可穿過(guò)胎盤屏障進(jìn)入母鼠體內(nèi)。

2.5 受孕母鼠心臟中表達(dá)GFP蛋白

圖3　血液中GFP基因的檢測(cè)Note.M：DNA molecular marker；Lane 1：Negative control；Lane 2：H2O；Lane 3：Surgery without pregnancy group；Lane 4-6：Surgery+pregnancy groups；Lane 7：Positive control.Fig.3 Detection of GFP gene in the blood

前文已經(jīng)通過(guò)心電圖、超聲心動(dòng)圖證實(shí)受孕可以改善心功能，并且通過(guò)血液PCR檢測(cè)也證實(shí)胚胎干細(xì)胞可進(jìn)入母體血液系統(tǒng)的事實(shí)，因此我們推測(cè)受孕母鼠心梗狀況的減輕是由于胚胎干細(xì)胞遷徙至受損心肌發(fā)揮的修復(fù)作用。為此我們通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)受孕母鼠心臟中是否表達(dá)GFP基因。以各組小鼠（各8只）心臟組織冰凍切片，進(jìn)行GFP免疫組織化學(xué)染色后結(jié)果如圖4所示，圖4A、B和C分別為手術(shù)+未受孕組免疫組化50倍、100倍及200倍鏡下圖片，在梗死區(qū)域附近未見(jiàn)GFP熒光蛋白褐色沉淀，但可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而D、E和F分別為手術(shù)+受孕組50倍、100倍及200倍鏡下圖片，在整個(gè)梗死區(qū)明顯可見(jiàn)大量GFP熒光蛋白褐色沉淀，證明有較多的含有GFP的胚胎干細(xì)胞存在于心肌梗死區(qū)，并可見(jiàn)部分炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖4　小鼠心肌組織中GFP熒光蛋白表達(dá)Note.A，B and C are respectively the microscopic images of×50，×100 and×200 in the same myocardial infarction area of surgery without pregnancy group，and no GFP fluorescent protein was detected in the cardiomyocytes.Figure D，E and F are respectively the microscopic images of×50，×100 and×200 in the same myocardial infarction area of surgery +pregnancy group，abundant brown cells were detected in the mouse myocardium.×50，bar=500 μm；×100，bar= 200 μm；×200，bar=100 μm.Fig.4 GFP expression in the mouse myocardial tissues

3　討論

心肌梗死及其引起的心力衰竭是導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的主要原因，目前主要治療方法為藥物治療、介入治療及“搭橋”手術(shù)治療等，但這些治療方法僅能緩解癥狀，延緩疾病進(jìn)展，不能根本上修復(fù)已經(jīng)壞死的心肌細(xì)胞。干細(xì)胞對(duì)各組織的修復(fù)作用已經(jīng)被國(guó)內(nèi)外研究所證實(shí)，如發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞可以存在于母孕鼠大腦、腎臟、肝臟、血液及皮膚等損傷部位［12-15］。那么胚胎干細(xì)胞是否可以通過(guò)胎盤屏障遷移至受損心肌發(fā)揮修復(fù)作用呢？

在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谶M(jìn)行小鼠心肌梗死模型后，通過(guò)心電圖和超聲心動(dòng)圖確認(rèn)模型是否成功，并利用二者觀察受孕是否能夠改善心肌梗死損傷。心電圖在心肌梗死診斷中具有特征性改變的演變規(guī)律，特異性強(qiáng)，敏感性高，對(duì)定性、定位、分類及預(yù)后評(píng)估等方面具有重要地位，特別是在前降支單支病變中具有重要提示作用［16］，更是確認(rèn)心肌梗死模型建立成功與否的金標(biāo)準(zhǔn)。心肌梗死時(shí)心電圖的演變分為三期［17］：超急性期在冠狀動(dòng)脈閉塞10分鐘到數(shù)小時(shí)內(nèi)，心電圖表現(xiàn)為巨大高聳的T波或ST段呈直立型升高；急性期歷時(shí)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，從ST段弓背向上抬高呈單向曲線，出現(xiàn)壞死型Q波，至ST段恢復(fù)到等電線，T波倒置。亞急性期數(shù)天至數(shù)周，表現(xiàn)為病理性Q波，T波逐漸恢復(fù)或表現(xiàn)慢性冠狀動(dòng)脈供血不足?；謴?fù)期心電圖僅殘留病理性Q波，如為小面積的心肌梗死，可不遺留病理性Q波。本實(shí)驗(yàn)中手術(shù)+非受孕組和手術(shù)+受孕組于急性期均表現(xiàn)為ST段弓背向上抬高呈單向曲線，提示模型建立成功；于1月后進(jìn)展至亞急性期，但手術(shù)+非受孕組心電圖僅表現(xiàn)為T波稍有恢復(fù)，而手術(shù)+受孕組心電圖T波恢復(fù)較為明顯。此外，超聲心動(dòng)圖結(jié)果也顯示手術(shù)+未受孕組雌鼠心臟心腔明顯擴(kuò)大，存在心肌梗死灶，心室重構(gòu)明顯，且出現(xiàn)心功能指數(shù)的明顯減低。而手術(shù)+受孕組雖仍有心臟結(jié)構(gòu)變化，但較手術(shù)+未受孕組已具有明顯改善。以上結(jié)果提示受孕對(duì)心肌損傷具有明顯的修復(fù)作用。

由于心肌細(xì)胞的不可再生性，心肌梗死后心肌細(xì)胞可發(fā)生壞死及心室重構(gòu)。因此我們推測(cè)受孕母鼠心梗癥狀減輕可能是由于胚胎干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)，分化為心肌細(xì)胞從而起到對(duì)母鼠心臟的修復(fù)作用。而國(guó)外也有報(bào)道，50%以上的自發(fā)性心力衰竭女性能自愈［18-19］，而圍產(chǎn)期心力衰竭的自愈率最高［20］，但其機(jī)理尚未闡明。我們利用GFP雄鼠與心梗模型雌鼠進(jìn)行交配，并且檢測(cè)到懷孕后1月母鼠的血液和心臟中具有GFP基因的表達(dá)，證實(shí)了GFP熒光蛋白標(biāo)記的胚胎干細(xì)胞可以通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)，遷徙至心肌梗死后的母鼠心肌損傷處起到修復(fù)作用。

本研究初步探索了胎兒母體干細(xì)胞轉(zhuǎn)移和微嵌合體現(xiàn)象，并且發(fā)現(xiàn)其對(duì)缺血損傷的心肌有可能存在一定的修復(fù)作用，從而為胚胎干細(xì)胞治療心臟疾病提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Repairing effect of embryonic stem cells on injured maternal myocardium in pregnant mice

WANG Hong-mao1，QIU Bin2，DENG-Ran2，WANG Chao2，YONG Wei-dong2，SHI Lin1*
（1.Department of Cardiovascular Diseases，Children's Hospital Affiliated to Capital Institute of Pediatrics，Beijing 100020，China；2.Institute of Laboratory Animal Science，Peking Union Medical College&Chinese Academy of Medical Sciences Laboratory of Gene and Development，Beijing 100021，China）

【Abstract】Objective To determine if fetal stem cells can enter the maternal circulation during pregnancy and repair the injuries of maternal heart.Methods C57 female mice at the age of 6-8 weeks were randomly assigned to three groups：sham control，surgery without pregnancy，and surgery with pregnancy（n=8，eath group）.The control sham group was developed by opening and closing of the chest.The other two groups underwent heart surgery.The myocardial infarction（MI）model was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery.Half of the surgical mice mated with e-GFP transgenic male mice，and another half group was not.Electrocardiogram（ECG）and echocardiographic images were recorded at pre-operation，post-operation and postpartum.The collected data were used to evaluate the heart function. The GFP expression was detected by immunohistochemistry and q-PCR.Results When compared with the sham group，both the ischemia surgery groups with and without pregnancy，the ECG ST segment was significantly increased.This measurement indicated that the myocardial ischemia surgery was successful，and no significant difference in the ST segments between two ischemia surgery groups was found.However，when ECG was measured in the surgical mice after postpartum，their myocardial ischemia was dramatically improved when compared with that of the ischemia surgery only mice.Echocardiographic images also indicated that both the surgery groups had myocardial ischemia，however，no significant difference was observed in the pregnant mice before and after postpartum.The order of the cardiac function indexes from high to low was the sham group，surgery with pregnancy group，and surgery with no pregnancy group；in particular，the cardiac function of pregnancy group was significantly enhanced compared with that of the surgery with no pregnancy group（P＜0.05）. More importantly，both immunofluorescence and q-PCR results showed that the embryonic stem cell translocation through circulation system with GFP expression in the heart of pregnancy group，while negative in other two groups.Conclusions Embryonic stem cells can be transferred into the maternal circulation of pregnant mice，and play a role in the repairing of their cardiac injuries.

【Key words】Embryonic stem cells；GFP；Myocardial ischemia；Cardiac repair；Mice；Pregnancy

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0127-07

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.004

［基金項(xiàng)目］中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（DWS201508）；863（2012AA02240）資助；國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2014ZX10004002-001）。

［作者簡(jiǎn)介］王宏茂（1986-），男，醫(yī)師，碩士學(xué)位，E-mail：sunnyboymao@126.com

［通訊作者］石琳，女，主任醫(yī)師，教授，E-mail：shilin9789@126.com

Corresponding author：SHI Lin，Email：shilin9789@126.com

［收稿日期］2015-12-05