邢進(jìn)，馮育芳，王洪，王吉，岳秉飛*，賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

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實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中沙門菌的實(shí)驗(yàn)室檢測能力驗(yàn)證的結(jié)果與分析

邢進(jìn)，馮育芳，王洪，王吉，岳秉飛*，賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050）

【摘要】目的 通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中沙門菌檢測能力驗(yàn)證計(jì)劃，了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)對(duì)沙門菌的檢驗(yàn)?zāi)芰?，提高?shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測水平。方法 按照CNAS批準(zhǔn)的能力驗(yàn)證方案，通過冷凍干燥法制備含有沙門菌及干擾菌的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便樣品，經(jīng)過穩(wěn)定性和均勻性檢驗(yàn)合格，作為能力驗(yàn)證樣品。采用隨機(jī)編號(hào)，經(jīng)冷鏈運(yùn)輸發(fā)放給參加單位，并附作業(yè)指導(dǎo)書。在規(guī)定時(shí)限提交檢驗(yàn)報(bào)告和原始記錄復(fù)印件，其結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果一致的判為滿意結(jié)果，不一致或未能提交結(jié)果的判為不滿意結(jié)果。結(jié)果 全國共有20個(gè)省市的30個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加沙門菌能力驗(yàn)證項(xiàng)目，其中28個(gè)實(shí)驗(yàn)室獲滿意結(jié)果，占總參加機(jī)構(gòu)的93.3%，不滿意的2個(gè)實(shí)驗(yàn)室，占6.7%。采用分離培養(yǎng)方法的有29個(gè)實(shí)驗(yàn)室，采用PCR方法的有2個(gè)實(shí)驗(yàn)室。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測機(jī)構(gòu)沙門菌檢測能力較高，實(shí)施能力驗(yàn)證計(jì)劃能夠反映實(shí)驗(yàn)室的檢測水平。

【關(guān)鍵詞】實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；沙門菌；能力驗(yàn)證；中國合格評(píng)定認(rèn)可委員會(huì)

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，確定實(shí)驗(yàn)室和檢查機(jī)構(gòu)從事特定測試活動(dòng)的技術(shù)能力的活動(dòng)，是實(shí)驗(yàn)室證明其技術(shù)能力的一種重要手段，也是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要工作。申請(qǐng)認(rèn)可和獲準(zhǔn)認(rèn)可的合格評(píng)定機(jī)構(gòu)必須通過參加能力驗(yàn)證，包括中國合格評(píng)定認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）組織實(shí)施或承認(rèn)的能力驗(yàn)證計(jì)劃、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)和測量審核，以證明其技術(shù)能力［1］。

中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）此前與CNAS已經(jīng)聯(lián)合舉辦了兩次能力驗(yàn)證工作，在病毒［2］、病原菌［3］和遺傳［4，5］檢測項(xiàng)目上積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。2015年中檢院順利通過了CNAS能力驗(yàn)證提供者（proficiency testing provider，簡稱PTP）的現(xiàn)場評(píng)審。CNAS評(píng)審組通過現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)、關(guān)鍵人員技術(shù)考核、記錄查考等方式，結(jié)合核查組織能力驗(yàn)證和比對(duì)實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷以及其報(bào)告對(duì)中檢院申請(qǐng)的食品、藥品、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等9個(gè)領(lǐng)域的24個(gè)產(chǎn)品，共60個(gè)項(xiàng)目/參數(shù)的PTP能力進(jìn)行了確認(rèn)，成為合格的能力驗(yàn)證提供者。

中檢院作為本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的 PTP，依據(jù)CNAS-RL02《能力驗(yàn)證規(guī)則》［1］和CNAS-RL03《能力驗(yàn)證提供者認(rèn)可準(zhǔn)則》（ISO/IEC 17043：2010）［6］運(yùn)作本次NIFDC-PT-037“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便中沙門菌檢測”的能力驗(yàn)證工作。

沙門菌是一種重要的人獸共患病原，能夠感染各種動(dòng)物，也是現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測國家標(biāo)準(zhǔn)中需首要排除的病原菌［7］。作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌檢測的最基本項(xiàng)目，本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能力驗(yàn)證項(xiàng)目設(shè)定為沙門菌，檢測要求是能夠檢測出樣品中的沙門菌，并準(zhǔn)確鑒定。

1　材料與方法

1.1 菌種

乙型副傷寒沙門菌CMCC 50094，大腸埃希菌CMCC 44110購自中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。奇異變形桿菌分離株，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 SPF大鼠

SPF級(jí)SD大鼠5只，體重200～250 g，2月齡，由中國食品藥品檢定研究院提供【SCXK（京）2014 -0013】。實(shí)驗(yàn)在中國食品藥品檢定研究院進(jìn)行【SYXK（京）2011-0008】。

1.3 主要試劑

DHL瓊脂、三糖鐵培養(yǎng)基、靛基質(zhì)、尿素、賴氨酸脫羧酶試劑購自北京三藥科技開發(fā)有限公司；SF增菌液和氰化鉀試劑購自青島海博；SS瓊脂購自O(shè)xoid；API 20E生化鑒定條購自生物梅里埃；革蘭陰性細(xì)菌鑒定板購自BD；沙門菌診斷血清購自寧波天潤。

1.4 主要儀器

Thermo Scientific A2生物安全柜、Thermo Scientific Heratherm恒溫培養(yǎng)箱、BD Phoenix-100細(xì)菌鑒定儀、Hettich冷凍離心機(jī)、Labconco凍干機(jī)。

1.5 樣品制備

將沙門菌、大腸埃希菌和變形桿菌分別用無菌生理鹽水制成菌懸液，與高壓滅菌的大鼠回盲內(nèi)容物均勻混合，制成1份陽性和2份陰性樣品，其中各菌濃度約為107CFU/g。三種樣品分裝于螺口1.5 mL無菌凍存管中，冷凍干燥，每管內(nèi)固體含量約為50～200 mg/管。通過軟件對(duì)樣品編號(hào)及實(shí)驗(yàn)室分組，每組3管樣品，包含1管陽性和2管陰性樣品，其中沙門菌、大腸埃希菌、變形桿菌各1管。實(shí)驗(yàn)室無法通過樣品編號(hào)識(shí)別組別，防止了實(shí)驗(yàn)室間對(duì)結(jié)果的相互串通。

1.6 樣品檢驗(yàn)

1.6.1 準(zhǔn)確性檢驗(yàn)

將制備樣品根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便中沙門菌檢測作業(yè)指導(dǎo)書處理，采用國標(biāo)方法［8］，對(duì)培養(yǎng)出的菌落形態(tài)和生化特征進(jìn)行鑒定和血清凝集實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 均勻性檢驗(yàn)

在3種樣品中分別隨機(jī)抽取20管樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，每管樣品重復(fù)測試3次。參照作業(yè)指導(dǎo)書，將樣品管中加入500 μL無菌水，用10 μL接種環(huán)接種一滿環(huán)菌液涂布于DHL瓊脂上，36℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落數(shù)。

1.6.3穩(wěn)定性檢驗(yàn)

設(shè)置5種溫度條件（37℃、25℃、4℃、-20℃和-80℃），每種溫度放置20組樣品，檢測樣品在各溫度下的穩(wěn)定性。37℃和25℃中樣品每天取樣，4℃中樣品每3 d取樣，-20℃中樣品每周取樣，-80℃中樣品每月取樣。參照作業(yè)指導(dǎo)書，將樣品管中加入500 μL無菌水，用10 μL接種環(huán)接種一滿環(huán)菌液涂布于DHL瓊脂上，36℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落生長情況。

1.7 樣品編號(hào)

本次能力驗(yàn)證樣品編號(hào)延續(xù)此前的能力驗(yàn)證樣品順序編號(hào)，隨機(jī)分組，由軟件自動(dòng)分配，確保每個(gè)參與實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)得到3種樣品，見表1。

表1　樣品編號(hào)設(shè)置Tab.1 Sample number setting

1.8 樣品運(yùn)輸

樣品通過干冰冷鏈運(yùn)輸寄送至參加實(shí)驗(yàn)室。

1.9 參加實(shí)驗(yàn)室

全國共有20個(gè)省市的30家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加本次能力驗(yàn)證計(jì)劃，其中北京4家，江蘇和四川各3家，甘肅、廣東、山東和上海各2家，貴州、河北、河南、湖北、湖南、吉林、江西、遼寧、陜西、天津、新疆、云南和浙江各1家。參與實(shí)驗(yàn)室的類型包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)17家，省級(jí)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室2家，省市級(jí)藥檢系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室4家，科研院校實(shí)驗(yàn)室6家，企業(yè)內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室1家。

1.10 檢測方法

本次能力驗(yàn)證未規(guī)定測試方法，建議實(shí)驗(yàn)室采用日常檢測方法，可參考GB/T 14926.1-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌檢測方法。要求在反饋結(jié)果同時(shí)提交完整的檢測報(bào)告。

1.11 結(jié)果評(píng)價(jià)原則

實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果完全一致，即判定為滿意結(jié)果；實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，判定為不滿意結(jié)果；未按時(shí)限反饋結(jié)果，判定為不滿意結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1 樣品準(zhǔn)確性

所抽檢的3種樣品中，沙門菌和變形桿菌在DHL和SS平皿上生長為邊緣無色、中央黑心的中等大小菌落，大腸埃希菌生長為粉紅色中等大小菌落，菌落形態(tài)準(zhǔn)確。國標(biāo)方法、API 20E和BD細(xì)菌鑒定儀的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、一致。血清凝集實(shí)驗(yàn)僅沙門菌與沙門菌多價(jià)診斷血清發(fā)生凝集。

2.2 樣品均勻性

3種樣品在DHL瓊脂平皿上的菌落數(shù)肉眼均不可計(jì)，達(dá)到樣品均勻性要求。

2.3 樣品穩(wěn)定性

3種樣品在37℃條件下可穩(wěn)定存放20 d，25℃下可穩(wěn)定存放40 d，4℃下至少可穩(wěn)定存放60 d，-20℃下至少可穩(wěn)定存放180 d，-80℃條件下至少可穩(wěn)定存放240 d。

2.4 結(jié)果反饋

所有參與實(shí)驗(yàn)室均按時(shí)反饋結(jié)果和報(bào)告。檢測結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室為28個(gè)，滿意率93.3%。不滿意實(shí)驗(yàn)室為2個(gè)，其中1個(gè)實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)測量審核并通過。

3　討論

3.1 方法的選擇

根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)，沙門菌的檢測程序?yàn)椋簩颖窘臃N于SF增菌液中再轉(zhuǎn)種于DHL或SS瓊脂培養(yǎng)基上，或直接接種上述兩種培養(yǎng)基上。經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24 h后，觀察有無產(chǎn)黑心或無色菌落。實(shí)際檢測中應(yīng)對(duì)產(chǎn)黑心和無色菌落進(jìn)行純培養(yǎng)并進(jìn)行生化鑒定。一般情況下，在初代培養(yǎng)時(shí)變形桿菌經(jīng)常與沙門菌的菌落形態(tài)相混淆，可以通過接種血瓊脂平皿的方法來篩選，方法簡便易行。變形桿菌在血瓊脂上會(huì)形成彌漫生長的菌苔，沙門菌則形成單個(gè)的菌落。為避免漏檢，應(yīng)挑取至少3個(gè)初代平皿中的可疑菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌的檢測不需要鑒定血清分型，因此血清凝集試驗(yàn)對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中沙門菌的檢測沒有決定意義。分子生物學(xué)方法的合理應(yīng)用可以快速得出結(jié)果，本次參與實(shí)驗(yàn)室中，一家實(shí)驗(yàn)室使用PCR方法進(jìn)行檢測，獲得滿意結(jié)果。

在參與單位中，對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)的有20個(gè)實(shí)驗(yàn)室，占66.7%，其余實(shí)驗(yàn)室將樣本直接接種于固體培養(yǎng)基。當(dāng)遇到臨床樣本中目標(biāo)菌量極少的情況時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3.2 不滿意結(jié)果原因分析

本次比對(duì)樣品中所加入的受試菌均為單一菌株，作為載體的回盲內(nèi)容物已經(jīng)過高壓滅菌，沒有雜菌的干擾。實(shí)驗(yàn)室404和468將陰性樣品檢測為陰性，但兩者錯(cuò)誤的樣品不同。實(shí)驗(yàn)室404將變形桿菌樣品檢測為陽性，實(shí)驗(yàn)室468將大腸埃希菌樣品檢測為陽性。從原始記錄分析，其檢測步驟根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，錯(cuò)誤原因可能為在檢測中造成了樣品間的交叉污染。

此外，本次所用變形桿菌的氰化鉀生長實(shí)驗(yàn)為緩慢生長，如果培養(yǎng)時(shí)間僅為24 h以內(nèi)，很可能得到氰化鉀假陰性結(jié)果，由此導(dǎo)致整體結(jié)果的誤判。

3.3 總結(jié)

一次能力驗(yàn)證的結(jié)果只能證明實(shí)驗(yàn)室參加的本次能力驗(yàn)證活動(dòng)的情況，不能說明實(shí)驗(yàn)室的檢測水平，只有持續(xù)參加同一項(xiàng)目的能力驗(yàn)證活動(dòng)，其總體結(jié)果才能反映實(shí)驗(yàn)室的能力狀況［1］。因此逐步完善和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物能力驗(yàn)證計(jì)劃，對(duì)于提升整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測工作的水平和能力具有積極意義。

CNAS-RL01：2011《實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可規(guī)則》、CNASRL02：2010《能力驗(yàn)證規(guī)則》規(guī)定申請(qǐng)認(rèn)可和獲準(zhǔn)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)室必須通過參加能力驗(yàn)證活動(dòng)（包括CNAS組織實(shí)施或承認(rèn)的能力驗(yàn)證計(jì)劃、測量審核）證明其技術(shù)能力［1，9］。只有在能力驗(yàn)證活動(dòng)中表現(xiàn)滿意，或?qū)τ诓粷M意結(jié)果能證明已開展了有效糾正措施的實(shí)驗(yàn)室，CNAS方受理認(rèn)可申請(qǐng)或予以認(rèn)可。當(dāng)不滿意結(jié)果已不能符合專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范時(shí)，除實(shí)施糾正措施并驗(yàn)證其有效性外，實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)自行暫停在相應(yīng)項(xiàng)目的證書/報(bào)告中使用CNAS認(rèn)可標(biāo)識(shí)。在驗(yàn)證糾正措施有效后，實(shí)驗(yàn)室可自行恢復(fù)使用認(rèn)可標(biāo)識(shí)。對(duì)不能滿足能力驗(yàn)證領(lǐng)域和頻次要求，或雖參加了能力驗(yàn)證但結(jié)果不滿意且未在180 d（能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告發(fā)布之日起計(jì)）內(nèi)開展糾正措施及其驗(yàn)證活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室，CNAS可撤銷其相應(yīng)項(xiàng)目的認(rèn)可資格。對(duì)參加了CNAS組織及其承認(rèn)的能力驗(yàn)證活動(dòng)且有穩(wěn)定滿意表現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)室，在CNAS的各類評(píng)審中可考慮適當(dāng)簡化相關(guān)項(xiàng)目的能力確認(rèn)過程。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保存上述記錄以備評(píng)審組檢查。

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Results and analysis of the proficiency of laboratories in detection of Salmonella in laboratory animals

XING Jin，F(xiàn)ENG Yu-fang，WANG Hong，WANG Ji，YUE Bing-fei*，HE Zheng-ming
（Department of Laboratory Animal Quality Testing，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing，100050，China）

【Abstract】Objective To understand the Salmonella detectability in the laboratory animal testing laboratories，improve the level of detection for the quality of laboratory animals，by means of laboratory animals Salmonella proficiency testing program.Method According to the proficiency testing program approved by CNAS，freeze-dried animal stool samples containing Salmonella bacteria and interference bacteria were prepared，and through stability and homogeneity tests qualified as proficiency testing samples.The randomly numbered samples were issued to the participating units by cold-chain transportation，and attached work instructions.The original reports and copies of the tests should be submitted on time.The sample results consistent with the results of the pretested results were considered as satisfactory，and the results inconsistent or fails to submit were judged as unsatisfactory.Results A total of 30 laboratories from 20 provinces and cities nationwide participated in this proficiency testing programs for Salmonella，including 28（93.3%）laboratories with satisfactory results，and two laboratories unsatisfactory（6.7%）.29 laboratories used separate culture methods，and two laboratories used PCR method.Conclusions The laboratory animal quality inspection agencies have good detection ability for Salmonella.The implementation of the capacity verification plan can well reflect the detection level of laboratories.

【Key words】Laboratory animal；Salmonella；Proficiency testing；China National Accreditation Service for Conformity，CNAS

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0191-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.015

［基金項(xiàng)目］國家科技支撐計(jì)劃：實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原分子生物學(xué)快速檢測新技術(shù)研究與應(yīng)用，課題編號(hào)2015BAI07B02。

［作者簡介］邢進(jìn)（1979-），男，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測。Email：xjvet@nifdc.org.cn。

［通訊作者］岳秉飛（1960-），男，博士，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。Email：y6784@126.com。

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13