付瑞，王洪，王淑菁，李曉波，王吉，衛(wèi)禮，岳秉飛

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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兔出血癥病毒抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)

付瑞，王洪，王淑菁，李曉波，王吉，衛(wèi)禮，岳秉飛*

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【摘要】目的 通過(guò)兔出血癥病毒抗體檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃，了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)?zāi)芰?，提高?shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)水平。方法 按照CNAS批準(zhǔn)的能力驗(yàn)證方案，通過(guò)篩選血清制備樣品，經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性和均勻性檢驗(yàn)合格，作為能力驗(yàn)證樣品。采用隨機(jī)編號(hào)，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導(dǎo)書。在規(guī)定時(shí)限提交檢驗(yàn)報(bào)告和原始記錄復(fù)印件，其結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果一致的判為滿意結(jié)果，不一致或未能提交結(jié)果的判為不滿意結(jié)果。結(jié)果 來(lái)自14個(gè)省市自治區(qū)的20個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加本次比對(duì)實(shí)驗(yàn)，均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)反饋了檢測(cè)結(jié)果，17個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為合格或優(yōu)秀，占參加比對(duì)實(shí)驗(yàn)室的85%。在20個(gè)實(shí)驗(yàn)室中，14個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）方法，6個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HAI）方法。結(jié)論 全國(guó)各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)兔出血癥病毒抗體總體檢測(cè)能力較高，實(shí)施能力驗(yàn)證計(jì)劃能夠反映實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平。

【關(guān)鍵詞】兔出血癥病毒；能力驗(yàn)證；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)；血凝抑制實(shí)驗(yàn)

兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種急性、致死性傳染病，對(duì)易感兔群的致病率達(dá)90%，病死率可高達(dá)100%，是對(duì)兔的一種毀滅性傳染?。?］。兔出血癥病毒是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病源微生物之一。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定采用血凝抑制（hemagglutination inhibition assay，HAI）的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)用兔中兔出血癥病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)［2］，基礎(chǔ)級(jí)兔如果接種疫苗，HAI抗體效價(jià)應(yīng)大于1∶10，同時(shí)免疫抗體合格率［（被檢動(dòng)物抗體陽(yáng)性數(shù)/被檢動(dòng)物總數(shù)）×100%］大于等于70%判定該兔群免疫合格；清潔級(jí)和SPF兔HAI抗體效價(jià)應(yīng)小于等于1∶10。該檢測(cè)方法操作較為繁瑣，對(duì)操作人員的能力要求較高。

為了提高國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的整體水平，中國(guó)食品藥品檢定研究院組織實(shí)施了全國(guó)范圍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室間兔出血癥病毒抗體檢測(cè)能力比對(duì)，目的是要了解參加實(shí)驗(yàn)室在本檢測(cè)項(xiàng)目上的技術(shù)水平和能力，分析考察實(shí)驗(yàn)室間差異，發(fā)現(xiàn)并解決檢驗(yàn)中存在的問(wèn)題，促進(jìn)各實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)質(zhì)量管理，提高檢測(cè)水平。

1　材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

強(qiáng)陽(yáng)性樣品和弱陽(yáng)性樣品篩選自北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)督檢驗(yàn)所收集的基礎(chǔ)級(jí)兔血清；陰性樣品采自中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)室提供的SPF級(jí)家兔。

1.2 組織及實(shí)施單位

本次能力驗(yàn)證代碼為“NIFDC-PT-021”，由中國(guó)食品藥品檢定研究院組織并實(shí)施。

1.3 參加單位

本次比對(duì)面向全國(guó)從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)工作的實(shí)驗(yàn)室，報(bào)名參加本次比對(duì)實(shí)驗(yàn)的共20個(gè)實(shí)驗(yàn)室，所有實(shí)驗(yàn)室均在截止日期前反饋結(jié)果。

1.4 樣品的制備與分裝

1）樣品的篩選及檢定：收集來(lái)自北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)督檢驗(yàn)的基礎(chǔ)級(jí)兔血清共210份，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［3］進(jìn)行檢驗(yàn)，分別測(cè)定 HAI抗體效價(jià)；采用心臟采血的方法采集SPF家兔血，8000 r/ min離心10 min，收集SPF家兔血清共50 mL，按照上述方法進(jìn)行檢驗(yàn)，測(cè)定其HAI抗體效價(jià)。

2）強(qiáng)陽(yáng)性樣品的制備與分裝：集中經(jīng)檢驗(yàn)HAI抗體效價(jià)≥1∶80的兔血清，混勻后進(jìn)行分裝，每支300 μL，共分裝100支。

3）弱陽(yáng)性樣品的制備與分裝：集中經(jīng)檢驗(yàn)HAI抗體效價(jià)為1∶20的兔血清樣品，混勻后進(jìn)行分裝，每支300 μL，共分裝100支。

4）陰性樣品的制備與分裝：集中經(jīng)檢驗(yàn)HAI抗體效價(jià)≤1∶10的SPF兔血清，混勻后進(jìn)行分裝，每支300 μL，共分裝100支。

1.5 樣品穩(wěn)定性測(cè)試［4］

從分裝的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性樣品中各取5支，分別放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于放置的0、24、48、72 h和 96 h分別各取一支，凍存于-20℃，作為穩(wěn)定性樣品，采用血凝抑制法分別測(cè)定各樣品HAI抗體效價(jià)。

1.6 樣品均一性測(cè)試

從分裝的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性樣品中各隨機(jī)抽取8支，采用血凝抑制法分別測(cè)定各樣品HAI效價(jià)，以確定分裝各樣品的均一性。

1.7 樣品發(fā)放及結(jié)果反饋

采用隨機(jī)編號(hào)的方法分別對(duì)各樣品進(jìn)行編號(hào)，編號(hào)規(guī)則為：CB-VIR-隨機(jī)編號(hào)。每個(gè)參加實(shí)驗(yàn)室提供3份兔血清樣品，每份1管，裝量300 μL，性狀為透明澄清液體。樣品采用內(nèi)外雙層包裝冷鏈運(yùn)輸，內(nèi)層為封口膜密封，外層用透明塑料自封袋包裝。

各實(shí)驗(yàn)室在收到樣品時(shí)，首先確認(rèn)樣品是否完好，并填寫《被測(cè)物品接收狀態(tài)確認(rèn)表》。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室于15個(gè)工作日內(nèi)完成檢測(cè)工作，并填寫《實(shí)驗(yàn)兔血清中兔出血癥病毒抗體檢測(cè)結(jié)果報(bào)告單》，同時(shí)將《被測(cè)物品接收狀態(tài)確認(rèn)表》、《實(shí)驗(yàn)兔血清中兔出血癥病毒抗體檢測(cè)結(jié)果報(bào)告單》、原始記錄復(fù)印件和正式檢測(cè)報(bào)告返回能力驗(yàn)證組織單位（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.8 結(jié)果評(píng)價(jià)原則［5］

本次檢測(cè)為定性檢測(cè)，結(jié)果以兔出血癥病毒抗體陽(yáng)性或陰性來(lái)表示，每個(gè)參加單位分發(fā)3個(gè)樣本，樣本經(jīng)比對(duì)實(shí)施機(jī)構(gòu)（中國(guó)食品食品藥品檢定研究院）檢測(cè)已經(jīng)確定陽(yáng)性或陰性，參加比對(duì)的實(shí)驗(yàn)室對(duì)發(fā)放的樣本按照國(guó)標(biāo)進(jìn)行定性檢測(cè)，最后將檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施機(jī)構(gòu)的結(jié)果進(jìn)行比較確認(rèn)是否相符。

本次計(jì)劃以下列準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的結(jié)果，即：實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果完全一致，即判定為優(yōu)秀；強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果以及陰性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一致，弱陽(yáng)性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，即判定為合格；強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果或者陰性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致，即判定為不合格；未按時(shí)限反饋結(jié)果，即判定為不合格。

2　結(jié)果

2.1 參加實(shí)驗(yàn)室分布

全國(guó)14個(gè)省市共20家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加本次能力驗(yàn)證計(jì)劃，實(shí)際參加20家，其中省級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)檢系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室15家（含國(guó)家質(zhì)檢中心），高校以及企業(yè)內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室3家，省級(jí)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室和省級(jí)藥檢院實(shí)驗(yàn)室各1家，20家實(shí)驗(yàn)室均反饋了結(jié)果。

2.2 樣品穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

取強(qiáng)陽(yáng)性樣本、弱陽(yáng)性樣本和陰性樣本各5份，于37℃下放置0、24、48、72 h和96 h，測(cè)定其HAI抗體效價(jià)，均應(yīng)符合標(biāo)準(zhǔn)（見(jiàn)表1）。

2.3 樣品均一性檢測(cè)結(jié)果

將強(qiáng)陽(yáng)性樣本、弱陽(yáng)性樣本和陰性樣本分別分裝成100份，各取8份進(jìn)行檢測(cè)，強(qiáng)陽(yáng)性樣本RHDV抗體HAI效價(jià)應(yīng)≥1∶80，弱陽(yáng)性樣本RHDV抗體HAI效價(jià)應(yīng)≥1∶20并＜1∶80，陰性樣本RHDV抗體HAI效價(jià)應(yīng)≤1∶10（見(jiàn)表2）。

2.4 各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果分析

參加驗(yàn)證的20家實(shí)驗(yàn)室，全部反饋了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，反饋實(shí)驗(yàn)結(jié)果的17家單位均符合預(yù)期，大部分實(shí)驗(yàn)室的原始記錄比較詳細(xì)明了，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可信，效果比較滿意。滿意率為85%（見(jiàn)表3）。

表1　樣品37℃穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Stability of the samples at 37℃

表2　樣品均一性檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection of the uniformity of the samples

表3　實(shí)驗(yàn)室比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3 Comparative analysis of the results of different laboratories

3　討論

由于至今還沒(méi)有適于RHDV增殖的敏感細(xì)胞，使得RHDV的檢測(cè)成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制中的一個(gè)難點(diǎn)。RHDV只和人紅血球發(fā)生凝集反應(yīng)，與兔或其他哺乳動(dòng)物紅血球均無(wú)凝集反應(yīng)。這是因?yàn)槿思t血球上存在ABH抗原，而其他哺乳動(dòng)物均無(wú)此抗原［6］。用人“O”型血球和RHDV抗原進(jìn)行的血凝抑制試驗(yàn)仍是目前經(jīng)常采用的病毒抗體診斷方法，但是有些RHDV的病毒株在通常溫度下沒(méi)有血凝反應(yīng)，而且血凝抑制實(shí)驗(yàn)操作較為繁雜，受實(shí)驗(yàn)人操作手法影響較大。而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）在某種程度上比血凝抑制實(shí)驗(yàn)靈敏度更高，更易于標(biāo)準(zhǔn)化。

本次能力驗(yàn)證共有20個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加，全部實(shí)驗(yàn)室均反饋結(jié)果，僅有3個(gè)實(shí)驗(yàn)室為不合格結(jié)果，合格率達(dá)到85%。其中12個(gè)實(shí)驗(yàn)室僅采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法，2個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)采用了ELISA和血凝抑制（HAI）兩種方法，在14個(gè)采用ELISA檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室中，12個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用進(jìn)口試劑盒（XpressBio公司），結(jié)果均為優(yōu)秀；1個(gè)實(shí)驗(yàn)室未注明試劑盒來(lái)源，結(jié)果為優(yōu)秀；1個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用國(guó)產(chǎn)試劑盒，結(jié)果為不合格。其余6個(gè)實(shí)驗(yàn)室均采用HAI方法，其中3個(gè)實(shí)驗(yàn)室為優(yōu)秀結(jié)果。其中14個(gè)采用ELISA檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室對(duì)于弱陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，8個(gè)采用了HAI檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)室對(duì)弱陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果5個(gè)為陽(yáng)性。分析表明ELISA檢測(cè)方法具有更好的靈敏度。

參考文獻(xiàn)

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Evaluation of the proficiency of laboratories for detection of rabbit hemorrhagic disease virus antibody

FU Rui，WANG Hong，WANG Shu-jing，LI Xiao-bo，WANG Ji，WEI Li，YUE Bing-fei*
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective Through the detection of rabbit hemorrhagic disease virus（RHDV）antibody，to investigate the capacity of experimental animal quality control laboratories，so as to improve their detection proficiency.Methods According to the program approved by CNAS，the screened samples were numbered randomly and tested for their stability and homogeneity.The random samples were issued to the participant laboratories with the Standard Operation Procedure （SOP）.The participant laboratories must submit the test reports and original records in time.The feedback results were judged by the rate of concordance with the anticipated results.Results Twenty laboratories from 14 provinces were enrolled in the evaluation，and all of them submitted detection results on time.ELISA methods were used in 14 laboratories，and hemagglutination inhibition（HAI）assay was used in 6 laboratories.The results of 17 laboratories were marked as pass or excellent，with a rate of pass of 85%.Conclusions The ability for detection of RHDV antibody in animal test laboratories in China is high.The implementation of capacity testing can reflect the level of quality control laboratories.

【Key words】Rabbit hemorrhagic disease virus；Proficiency testing；ELISA；Hemagglutination inhibition assay，HAI

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0188-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.014

［基金項(xiàng)目］國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAI07B02）：實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物病原分子生物學(xué)快速檢測(cè)新技術(shù)研究與應(yīng)用。

［作者簡(jiǎn)介］付瑞（1978-），男，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。Email：furui78@126.com

［通訊作者］岳秉飛（1960-），研究員；研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)；Email：y6784@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13