王吉，付瑞，李曉波，王淑菁，衛(wèi)禮，邢進(jìn)，馮育芳，王洪，岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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專題研究

實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體的實驗室檢測能力驗證結(jié)果評價

王吉，付瑞，李曉波，王淑菁，衛(wèi)禮，邢進(jìn)，馮育芳，王洪，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【編者按】實驗動物質(zhì)量檢測作為質(zhì)量控制的重要手段，其質(zhì)量保證體系運行是否有效備受關(guān)注。如何檢驗一個檢測室能力是否穩(wěn)定？參加能力驗證（Proficiency Testing，PT）是有效方式之一。能力驗證是利用實驗室間比對來確定實驗室檢測能力的質(zhì)量評價活動。參加能力驗證，不僅為實驗室提供了一個評價和證明自身檢測能力，出具科學(xué)結(jié)果的重要手段，而且提供了一種有效的外部質(zhì)量監(jiān)控方式。同時也為實驗室提供了一個尋求改進(jìn)和提高的契機(jī)。為政府和社會了解實驗室檢測能力的重要方式。近些年，國內(nèi)實驗動物檢測實驗室進(jìn)行了多項能力驗證計劃，對強(qiáng)化質(zhì)量管理、提高我國實驗動物質(zhì)量檢測網(wǎng)絡(luò)水平發(fā)揮了重要作用，為推動實驗動物質(zhì)量檢測能力驗證工作，專題組織者將近兩年開展的能力驗證項目進(jìn)行總結(jié)，整理成文，供各位同仁一起研討。

【摘要】目的 通過實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測能力驗證計劃，了解實驗動物檢測機(jī)構(gòu)檢驗?zāi)芰?，提高實驗動物質(zhì)量檢測水平。方法 按照CNAS批準(zhǔn)的能力驗證方案，血清經(jīng)過標(biāo)定后，經(jīng)過穩(wěn)定性和均勻性檢驗合格，作為能力驗證樣品。采用隨機(jī)編號，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導(dǎo)書。在規(guī)定時限提交檢驗報告和原始記錄復(fù)印件，其結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果一致的判為滿意結(jié)果，不一致或未能提交結(jié)果的判為不滿意結(jié)果。結(jié)果 共有17個省市的27個實驗動物檢測機(jī)構(gòu)報名參加本次能力驗證項目。27個檢測機(jī)構(gòu)均提交了滿意結(jié)果，占總參加機(jī)構(gòu)的100%。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）方法的有26個檢測機(jī)構(gòu)，采用免疫熒光實驗（IFA）方法的有1個檢測機(jī)構(gòu)。結(jié)論 實驗動物質(zhì)量檢測機(jī)構(gòu)實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測能力較高，實施能力驗證計劃能夠反映實驗室的檢測水平。

【關(guān)鍵詞】呼腸孤病毒Ⅲ型；檢測能力驗證；酶聯(lián)免疫吸附實驗；免疫熒光實驗

為了進(jìn)一步提高我國實驗動物質(zhì)量檢測相關(guān)機(jī)構(gòu)的整體檢測水平，2015年由中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）組織，中國食品藥品檢定研究院計劃實施了全國范圍內(nèi)實驗動物檢測機(jī)構(gòu)實驗小鼠呼腸孤病毒IⅡ型抗體檢測能力驗證計劃。

呼腸孤病毒IⅡ型（mammalian orthoreovirus 3，Reo3）屬呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬。此種病毒可感染所有哺乳動物，包括小鼠、地鼠、豚鼠、貓和犬等［1-3］。并且能在猴、豚鼠、地鼠、貓、狗、豬和牛的原代腎細(xì)胞以及Hela、KB、FL和L細(xì)胞等傳代細(xì)胞中增殖并引起細(xì)胞病變。Reo3也能感染人，能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾病［1，2-5］。Reo3是SPF等級實驗動物必須排除的病原微生物之一。實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定可以采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）、免疫熒光試驗（IFA）和免疫酶試驗（IEA）開展對SPF實驗小鼠體內(nèi)呼腸孤病毒Ⅲ型抗體的檢測［6-9］。

其目的是要了解我國目前實驗動物檢測機(jī)構(gòu)在實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測方面的技術(shù)水平和能力。通過比較各檢測機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果的不同，分析產(chǎn)生不同檢測結(jié)果的原因，解決目前在我國實驗動物檢驗中存在的問題，從而促進(jìn)我國實驗動物檢測機(jī)構(gòu)整體檢測技術(shù)水平的提高。

1　材料與方法

1.1 能力驗證計劃開展

驗證項目：實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測；開展時間：2015年10月；驗證代碼：NIFDC-PT-036；組織單位：中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）；計劃實施單位：中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）。

1.2 能力驗證計劃的發(fā)布

本次能力驗證計劃實施前6個月在全國實驗動物檢測網(wǎng)絡(luò)公開，面向全國實驗動物檢測機(jī)構(gòu)。國內(nèi)具備實驗動物檢測檢測能力和資質(zhì)的所有實驗動物檢測機(jī)構(gòu)相關(guān)實驗室均可報名參加。并規(guī)定了能力驗證時間及檢測結(jié)果反饋截至?xí)r間。

1.3 能力驗證主要實驗材料

實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）抗體陽性血清、實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）抗體陰性血清：本室凍存；呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）抗原包被板和抗原片：本室制備；羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-FITC：KPL公司；商品化實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體ELISA試劑盒：國外某公司產(chǎn)品。

1.4 比對樣本的檢測及標(biāo)定

此次比對實驗需要3個樣本（編號分別為樣本1、樣本2、樣本3），3個樣本肉眼觀察性狀均應(yīng)為澄清、透明、無絮狀物的淡黃色液體。3個樣本按國標(biāo)ELISA方法測定后，分別用 IFA方法和商品化ELISA檢測試劑盒進(jìn)行標(biāo)定［7，9，10］。ELISA和 IFA均按國標(biāo)要求進(jìn)行操作［7，9］，商品化試劑盒按說明書進(jìn)行操作。

1.5 比對樣本的分裝及編號

取3個經(jīng)過標(biāo)定的樣本各分裝100支，每支150 μL。外包裝均一致，樣本性狀顏色均一致。由實施單位將所有樣本進(jìn)行隨機(jī)編號，并記錄每支樣本編號和相對應(yīng)的結(jié)果。

1.6 樣本均一性測定

3個比對樣本隨機(jī)各取15支用ELISA法測定其A值。通過計算這15支樣本的A值的變異系數(shù)來評價樣本的均一性［10］。

1.7 樣本穩(wěn)定性測定

3個比對樣本各15支，分別于37℃下放置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 d，每天分別各取一支，凍存于-70℃，作為穩(wěn)定性樣品。采用ELISA方法分別測定各樣本A值，計算3個樣本放置15 d的相對偏差以評價樣本的穩(wěn)定性［10］。

1.8 樣本的分發(fā)

將經(jīng)過均一性和穩(wěn)定性試驗均符合要求的比對樣本，分發(fā)給各報名參加比對單位。每個單位分發(fā)3個樣本。并由實施單位記錄不同單位相對應(yīng)的樣本編號，通過冷鏈保持低溫運輸。

1.9 方法的采用

本次能力驗證在檢測方法方面沒有限定，各參加實驗室既可以采用實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測方法［6］，也可以采用非標(biāo)方法。

1.10 比對結(jié)果評價標(biāo)準(zhǔn)

此次比對實驗為定性檢測，樣本檢測結(jié)果以陰性（-）或陽性（+）來表示。比對單位在規(guī)定截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，并且3個樣本的檢測結(jié)果與實施單位分發(fā)樣本的預(yù)期結(jié)果均相符，判為滿意；比對單位未在截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，或者比對樣本中有一個結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不相符，則判為不滿意［10-12］。

2　結(jié)果

2.1 參加此次能力驗證計劃檢測機(jī)構(gòu)及其編號規(guī)則

報名參加此次能力驗證計劃的共有國內(nèi)27個實驗動物檢測機(jī)構(gòu)。由中檢院賦予每個檢測機(jī)構(gòu)一個代碼，以“NIFDC-PT-036-編號”表示。凡說明參加機(jī)構(gòu)反饋的檢測結(jié)果及其評價，均以相應(yīng)代碼替代。

2.2 樣本標(biāo)定

經(jīng)ELISA檢測樣本1和樣本2為陽性，樣本3為陰性。3個樣本經(jīng)IFA法和商品化ELISA試劑進(jìn)行標(biāo)定，檢測結(jié)果完全相符，結(jié)果見表1。

2.3 樣本均一性測定

3個樣本A值的變異系數(shù)分別為4.5%、3.4% 和14.0%，結(jié)果見表2。

2.4 樣本的穩(wěn)定性測定

穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示3個樣本在37℃放置1～15 d相對偏差分別為2.7%、4.8%和13.9%，結(jié)果見表2。

2.5 參加能力驗證實驗室行業(yè)分布

經(jīng)過統(tǒng)計，除15家實驗動物檢測機(jī)構(gòu)參加此次能力驗證外，還有各省市疾病預(yù)防控制中心4家、藥品檢定研究院1家、生物醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)及科研院所等7家也參加了此次能力驗證。

2.6 參加能力驗證實驗室地區(qū)分布

本次能力驗證的27個國內(nèi)檢測機(jī)構(gòu)，分別來自國內(nèi)17個省/市/自治區(qū)。其中北京最多為4家，其次是江蘇為3家，上海、廣東、山東、四川、湖北分別為2家，天津、河北、遼寧、黑龍江、新疆、陜西、河南、浙江、江西、湖南各1家。涵蓋了我國西北、西南、華北、華南、華東、東北及江浙、湖南及湖北等地區(qū)。

2.7 比對樣本檢測結(jié)果分析

參加比對的27個實驗室均在規(guī)定時間內(nèi)反饋了3個樣本的檢測結(jié)果。表3為27個實驗室代碼及其相對應(yīng)的樣本編號及其檢測結(jié)果。

表1　比對樣本標(biāo)定結(jié)果（A值）Tab.1 Results of the sample calibration（A value）

表2　樣本均一性及穩(wěn)定性測定結(jié)果（A值）Tab.2 Results of detection uniformity and detection stability of the samples（A value）

表3　實驗室比對實驗結(jié)果分析Tab.3 Comparison of the test results with standard results

從表3統(tǒng)計結(jié)果看，27個實驗室在規(guī)定時間內(nèi)反饋的各自的3個樣本檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符，此次比對實驗27個實驗室評價結(jié)果均為滿意。

3　討論

此次能力驗證的比對樣本應(yīng)中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）要求，均做了標(biāo)定和均一性、穩(wěn)定性試驗。標(biāo)定結(jié)果顯示2種方法（ELISA和IFA）檢測結(jié)果完全一致；均一性實驗結(jié)果顯示3個樣本的變異系數(shù)均小于15%；穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示3個樣本的相對偏差均小于25%。說明提供的3個樣本均符合比對樣本的要求［10-12］。

參加本次能力驗證的27家實驗室均在規(guī)定時間內(nèi)反饋結(jié)果。有26家采用ELISA進(jìn)行檢測，有1家采用IFA進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符，滿意率為100%。27家實驗室的原始記錄均清晰完整，檢測結(jié)果真實可信。表明參加比對的27家實驗室均具備檢測實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體的能力。與本實驗室2013年（2013年參加單位有13個省市17個單位，檢測結(jié)果滿意率為87.5%）開展的實驗動物病毒項目能力驗證計劃比［10］，此次能力比對實驗參加的單位數(shù)量增多，檢測結(jié)果滿意率有所增加。由此可見我國具有實驗動物質(zhì)量檢測能力的機(jī)構(gòu)在增加，且檢測能力和水平也在提高。

實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ檢測現(xiàn)行國標(biāo)推薦方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫酶試驗（IEA）和免疫熒光試驗（IFA）［6］。27家實驗室中有26家采用ELISA方法，且26家實驗室檢測結(jié)果符合率均為100%。由此可見酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）由于其具有微量、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、方便、安全和結(jié)果客觀等特點，仍被實驗動物檢測機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用［13］。26家采用ELISA方法檢測實驗室，有11家采用國內(nèi)檢測試劑盒進(jìn)行檢測，有10家采用國外檢測試劑盒進(jìn)行檢測，說明國內(nèi)和國外小鼠Reo3抗體ELISA檢測試劑盒均可以用于實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型的檢測。有5家報告中沒有提供試劑盒來源，建議在以后的比對實驗報告中將試劑盒來源說明，以便對檢測結(jié)果及檢測試劑進(jìn)行評價和分析，將更加有利于我國實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型檢測的開展及能力的提高。

實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定陽性檢測結(jié)果需要復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果與初檢結(jié)果一致，方可判為陽性［6］。從本次比對實驗看，有部分實驗室對陽性結(jié)果進(jìn)行了復(fù)檢，符合實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)中實驗小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型檢測結(jié)果的判定。建議其他實驗室對陽性檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢方可對檢測樣本進(jìn)行結(jié)果判定，既符合國標(biāo)檢測要求，又使結(jié)果更加真實可靠。

參考文獻(xiàn)

［1］ 田克恭.實驗動物病毒性疾?。跰］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1992，83-88.

［2］ 王吉，衛(wèi)禮，岳秉飛，等.呼腸孤病毒Ⅲ型免疫熒光檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國醫(yī)學(xué)比較雜志，2011，21（8）：1 -4.

［3］ 王吉，衛(wèi)禮，賀爭鳴，等.呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）RT-PCR檢測方法的建立［J］.中國醫(yī)學(xué)比較雜志，2012，22（9）：46-50.

［4］ Roner MR，Steele BG.Features of the mammalian orthoreovirus 3 Dearingl 1 single-stranded RNA that direct packaging and serotype restriction［J］.J Gen Virol.2007，88（12）：3401-3412.

［5］ Tyler KL，Barton ES，Ibach ML，et al.Isolation and molecular characterization of a novel type 3 reovirus from a child with meningitis［J］.J Infect Dis.2004，189（9）：1664-1675.

［6］ 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.25-2001《實驗動物呼腸孤病毒Ⅲ型檢測方法》［S］.23-244.

［7］ 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.50-2001《實驗動物微生物學(xué)檢測方法》［S］.酶聯(lián)免疫吸附試驗：1-4.

［8］ 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.51-2001《實驗動物微生物學(xué)檢測方法》［S］.免疫酶試驗：5-7.

［9］ 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.52-2001《實驗動物微生物學(xué)檢測方法》［S］.免疫熒光試驗：10-12.

［10］ 李曉波，王洪，付瑞，等.實驗大鼠細(xì)小病毒H-1株抗體檢測能力驗證結(jié)果評價［J］.中國藥事，2014，28（9）：990-994.

［11］ 中國合格評定國家認(rèn)可委員會.能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南［S］.CNAS-GL03，2006.

［12］ 中國合格評定國家認(rèn)可委員會.能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南［S］.CNAS-GL02，2006.

［13］ 王吉，衛(wèi)禮，鞏薇，等.乙型腦炎病毒（JEV）ELISA檢測方法的建立［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（8）：56-59.

Evaluation of the detection proficiency of laboratories testing of mammalian orthoreovirus 3 antibody in laboratory mice

WANG Ji，F(xiàn)U Rui，LI Xiao-bo，WANG Shu-jing，WEI Li，XING Jin，F(xiàn)ENG Yu-fang，WANG Hong，YUE Bing-fei*
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective Through the proficiency validation of testing of mammalian orthoreovirus 3（Reo3）antibody in laboratory mice，to investigate the capacity of experimental animal quality control laboratories，so as to improve the detection capacity.Methods According to the program approved by CNAS，serum samples after calibration were tested for stability and homogeneity，and numbered randomly.The random samples were issued to the participant laboratories with the Standard Operation Procedure（SOP）.The participants must submit the test reports and original records in time.The feed-back results were judged by the concordance rate with the anticipated results.Results 27 laboratories from 17 provinces were enrolled in this evaluation project，all of them submitted detection results on time.Results All the 27 laboratories were marked as pass or excellent，with a pass rate of 100%.ELISA was used in 26 laboratories，and immunofluorescence assay was used in one laboratory.Conclusions The ability for detection of Reo3 antibody in laboratory mice in animal test laboratories is high.The implementation of proficiency testing can reflect the inspection level of quality control laboratories.

【Key words】Mammalian orthoreovirus 3（Reo3）；Detection capacity evaluation；ELISA；Immunofluorescence assay

【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0183-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.013

［基金項目］國家科技支撐計劃（2015BAI09B02）。

［作者簡介］王吉（1974-），女，副研究員，從事微生物學(xué)和免疫學(xué)研究副研究員。Email：wj-nd-jds@sina.com

［通訊作者］岳秉飛（1960-），研究員；研究方向：實驗動物學(xué)；電話：010-67095401；Email：y6784@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13