王建成， 何之星

肺孢菌肺炎（Pneumocystispenumonia，PCP），是由耶氏肺孢菌（Pneumocystis jirovecii）引起的致死性呼吸系統(tǒng)機(jī)會(huì)性感染。即使引入高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療（HAART），PCP仍為HIV感染患者主要的并發(fā)疾病[1]，隨著癌癥患者、器官移植者等PCP高危人群的擴(kuò)大，非HIV感染PCP患者日趨增多[2-3]。在世界范圍內(nèi)，PCP處于侵襲性真菌感染的第2位[4]，未經(jīng)干預(yù)的PCP患者病死率接近100%。PCP臨床癥狀、體征無(wú)特異性，致病機(jī)制尚不明確，缺乏無(wú)創(chuàng)、敏感的早期診斷方法。痰液和支氣管肺泡灌洗液（BALF）標(biāo)本病原體染色鏡檢為診斷PCP的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但痰液標(biāo)本檢出率低，支氣管肺泡灌洗屬于有創(chuàng)操作，兒童患者或呼吸道功能衰竭患者難以耐受。近年來(lái)，無(wú)創(chuàng)、方便的侵襲性真菌感染檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)，如乳酸脫氫酶（LDH）、(1，3)-β-D 葡聚糖等被用于PCP輔助診斷，并取得一定效果[5-6]。主要表面糖蛋白（Msg）是肺孢菌胞壁主要成分，具有高度免疫原性及保護(hù)性B細(xì)胞和T細(xì)胞表位。Msg包括Msg A、Msg B和Msg C。Msg C 由MSG基因更為保守的C-末端編碼，抗原性最強(qiáng)，目前多采用重組Msg C抗原進(jìn)行PCP血清學(xué)研究[7]。MSG基因?qū)儆诙嗫截惢颍看伪磉_(dá)的Msg抗原不盡相同，且MSG基因拷貝間通過(guò)重組導(dǎo)致變異，這些機(jī)制導(dǎo)致耶氏肺孢菌 Msg抗原的多樣性，以利于其逃避宿主免疫攻擊[8]。不同地區(qū)的PCP患者血清對(duì)耶氏肺孢菌 Msg C亞型識(shí)別能力存在很大差異[9]。因此，合成能夠與不同地區(qū)PCP患者血清抗體結(jié)合的共有抗原可能具有重要臨床意義。本實(shí)驗(yàn)采用真核表達(dá)的Msg C共有抗原對(duì)PCP高危人群進(jìn)行血清IgM檢測(cè)，評(píng)價(jià)其臨床意 義。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

血清標(biāo)本來(lái)自2017年1－12月我院48例行支氣管肺泡灌洗檢查的非HIV感染PCP高危人群（高危組）和51例健康體檢者（對(duì)照組）。高危組中男21例，女27例，平均年齡（56.5±15.9）歲；其中實(shí)體腫瘤化療患者17例，白血病化療患者15例，器官移植患者6例，自身免疫性疾?。?lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎等）患者10例；對(duì)照組男23例，女28例，平均年齡（52.0±16.9）歲。

1.2 血清抗Msg C共有抗原IgM酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）方法

1.2.1 陰性標(biāo)準(zhǔn)血清制備 將復(fù)溶后的重組耶氏肺孢菌 Msg C 共有抗原（在美國(guó)杜克大學(xué)人類(lèi)疫苗研究所完成設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和純化）按100 μg/cm2的量滴加在硝酸纖維（nitrocellulose，NC）膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后用PBS洗膜，將重組抗原標(biāo)記的NC膜放入20例隨機(jī)血清中，作用1 h后棄NC膜，按上述方法重復(fù)1次，制備陰性標(biāo)準(zhǔn)血 清。

1.2.2 血清抗Msg C共有抗原 IgM ELISA檢測(cè) 重組耶氏肺孢菌 Msg C 共有抗原按200 ng（濃度為2 mg/L）包被量包被96 孔板，2～8℃過(guò)夜，洗板2次，拍干后5%脫脂牛奶的PBS 封閉4 h后，拍干、過(guò)夜干燥后密封，2～8℃保存。將臨床樣本和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清用PBS液按1∶10稀釋?zhuān)O(shè)空白對(duì)照，加樣后2～8℃過(guò)夜， 每孔加入100 μL 1/750羊抗人IgG-HRP酶工作液，37℃，孵育60 min。充分洗板后加入A和B顯色液各50 μL，37℃，孵育5 min，2 mol/L H2SO4終止后用酶標(biāo)儀（450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)）檢測(cè)。每一塊酶標(biāo)板都帶上20例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤(pán)和4孔空白對(duì)照。用陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤(pán)的結(jié)果定義每塊酶標(biāo)板檢測(cè)的cutoff值。樣本D值=樣本（D450～D630）- [空白（D450～D630）]，計(jì)算20 例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清D值的95百分位數(shù)（Percentile 95，P95），如果陰性血清標(biāo)本出現(xiàn)離群值后刪除該值重新計(jì)算P95。樣本D值大于陰性標(biāo)準(zhǔn)血清P95D值的2.1倍定義為陽(yáng)性。

1.2.3 (1，3)-β-D葡聚糖檢測(cè) 將-20℃冷凍保存的高危組和對(duì)照組血清學(xué)標(biāo)本復(fù)融后，使用北京金山川科技發(fā)展公司的(1，3)-β-D 真菌檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，反應(yīng)結(jié)束后系統(tǒng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算出待測(cè)血漿中葡聚糖含量，(1，3)-β-D葡聚糖值＞60 ng/L，即判定為陽(yáng) 性。

1.2.4 呼吸道標(biāo)本肺孢菌PCR檢測(cè) 高危組48份支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本按常規(guī)PCR方法擴(kuò)增肺孢菌線粒體大亞基rRNA編碼基因，具體步驟見(jiàn)文獻(xiàn) [10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布采用K-S檢驗(yàn)（Kolmogorov-Smirnov），非正態(tài)分布計(jì)量資料采用配對(duì)資料的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗Msg C 共有抗原IgM 抗體ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 陰性標(biāo)準(zhǔn)血清制備 20例對(duì)照血清重組抗原吸附前后，抗Msg C共有抗原 IgM抗體檢測(cè)D均為非正態(tài)分布，吸附前后D中位值分別為0.18和0.13，經(jīng)配對(duì)資料的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)顯示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.1.2 高危組和對(duì)照組兩種血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 99例標(biāo)本中Msg C 共有抗原IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性率為28.3%（28例），(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)陽(yáng)性率25.3%（25例），兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在高危組48例標(biāo)本中兩者陽(yáng)性率差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（35.4%和33.3%）。見(jiàn)表1。兩種檢測(cè)方法總體一致性和高危組一致性分別為67.7%和52.1%。

表1 高危組和對(duì)照組Msg C共有抗原 IgM 抗體和(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)結(jié)果Table 1 IgM antibody against Msg C consensus antigen and (1，3)-β-D glucan test in patients at high risk of Pneumocystis pneumonia and healthy control group[n ( % ) ]

2.1.3 高危組Msg C共有抗原 IgM 抗體檢測(cè)與PCR檢測(cè)結(jié)果比較 48例支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本PCR檢測(cè)15例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為31.2%（15/48），與Msg C共有抗原 IgM抗體檢測(cè)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.665）；高危組Msg C共有抗原 IgM抗體檢測(cè)與PCR一致性為58.3%。見(jiàn)表2。在兩種血清學(xué)方法檢驗(yàn)結(jié)果一致的25例標(biāo)本中，與PCR結(jié)果一致性可提升到84.0%；若以任一種血清學(xué)陽(yáng)性結(jié)果作為判讀陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，在高危組15例PCR陽(yáng)性標(biāo)本中的檢出率達(dá)86.7%（13/15）。

表2 Msg C 共有抗原IgM 抗體檢測(cè)與PCR檢測(cè)結(jié)果比較Table 2 Results of IgM antibody against Msg C consensus antigen compared with PCR assay

3 討論

重組Msg抗原在PCP的血清學(xué)診斷和疫苗研制領(lǐng)域均表現(xiàn)出潛在價(jià)值，已經(jīng)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了有效性[11]。野生 Msg抗原高度變異性導(dǎo)致各抗原亞型不能被彼此誘導(dǎo)的抗體識(shí)別，依據(jù)某一基因型制備的DNA疫苗/基因工程疫苗，其誘導(dǎo)的抗體不能對(duì)表達(dá)其他抗原亞型的菌株產(chǎn)生保護(hù)作用。共有DNA（consensus DNA）合成技術(shù)是將編碼某一抗原的不同等位基因，通過(guò)生物技術(shù)軟件進(jìn)行編排（align）后，生成一條共有DNA鏈，克隆表達(dá)得到共有抗原，該抗原具有不同等位基因所編碼抗原的免疫原共性，更易誘發(fā)適用于不同病毒亞型的廣泛性中和抗體，該技術(shù)在HIV和流感免疫學(xué)診治中發(fā)揮重要的作用[12-13]。我們?cè)谠缙谘芯恐凶C實(shí)了共有抗原比野生抗原具有更好的檢測(cè)陽(yáng)性率。

本研究采用Msg C共有抗原吸附20名健康人血清制備標(biāo)準(zhǔn)陰性血清，結(jié)果顯示吸附后所制備的標(biāo)準(zhǔn)陰性血清IgM抗體D值顯著降低（P＜0.01），保證了陰性血清的可靠性。此外，本課題采取2項(xiàng)改進(jìn)措施以保證陰性血清D值的科學(xué)性。其一，考慮ELISA反應(yīng)時(shí)間、溫度以及不同操作人員可能都會(huì)對(duì)反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生影響，在每一塊酶標(biāo)板檢測(cè)內(nèi)都帶上了20例陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤(pán)，用陰性標(biāo)準(zhǔn)血清盤(pán)的結(jié)果定義每塊酶標(biāo)板檢測(cè)的cutoff值，以此作為本板試驗(yàn)的臨界值判定依據(jù)；其二，如果陰性血清標(biāo)本出現(xiàn)離群值后刪除該值重新計(jì)算P95。本研究PCP高危人群共有抗原IgM抗體陽(yáng)性率（35.4%）低于文獻(xiàn)所報(bào)道的合成抗原IgM抗體陽(yáng)性率（68.0%）[14]，原因是研究對(duì)象、檢驗(yàn)方法和陽(yáng)性判定方式不同，如果采用受試者工作特征曲線（ROC）分析確定陽(yáng)性cuttoff值，共有抗原在PCP高危人群IgM抗體陽(yáng)性率可以提高到71.2%，該陽(yáng)性率高于文獻(xiàn)報(bào)道，原因是研究對(duì)象均為非HIV感染人群，非HIV感染患者M(jìn)sg IgM抗體水平高于HIV感染患者[15-16]。

(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)是目前用于深部真菌感染輔助診斷的常用方法[17-18]，(1，3)-β-D 葡聚糖廣泛存在于真菌細(xì)胞壁中，真菌被吞噬細(xì)胞吞噬處理后，其即可從胞壁中釋放出來(lái)，導(dǎo)致血液及其他體液中含量升高。由于肺孢菌經(jīng)18S核糖體鑒定為真菌，故(1，3)-β-D 葡聚糖亦被用于PCP的血清學(xué)診斷[19-20]。本實(shí)驗(yàn)PCP高危人群(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)陽(yáng)性率為33.3%，顯著低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，主要原因是研究對(duì)象的差別，國(guó)外多入組已確診的PCP患者[21]，本研究納入的對(duì)象大部分為尚未明確診斷的高危人群。

本研究結(jié)果顯示，Msg C共有抗原IgM檢測(cè)和(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)在高危組和對(duì)照組陽(yáng)性率均無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步分析顯示兩種檢測(cè)方法的總體樣本和高危組一致性分別為67.7%和52.1%，均處于較低水平?？赡苤饕蚴莾烧邫z測(cè)靶物質(zhì)不同，且受到的干擾因素亦不相同，如果增加樣本數(shù)則陽(yáng)性率差異可能會(huì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異。

下呼吸道標(biāo)本PCR檢測(cè)是呼吸道肺孢菌存在直接證據(jù)，本研究48例PCP高危人群中15例陽(yáng)性，陽(yáng)性率與兩種血清學(xué)方法相近，分析顯示PCR與兩種血清學(xué)方法一致性均處于較低水平（58.3%和72.9%）。在兩種血清學(xué)方法檢驗(yàn)結(jié)果一致的25例標(biāo)本中，與PCR結(jié)果一致性可提升到84.0%；若以任一種血清學(xué)陽(yáng)性結(jié)果作為判讀陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，在高危組15例PCR陽(yáng)性標(biāo)本中只漏檢2例，具有較好的陽(yáng)性率。因此，在兒童、老年患者等BALF難以獲得的群體中，聯(lián)合應(yīng)用Msg C共有抗原 IgM 抗體檢測(cè)、(1，3)-β-D葡聚糖檢測(cè)可一定程度上替代PCR方法。

進(jìn)一步分析(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)定量結(jié)果與PCR結(jié)果相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在14例(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)＞180 ng/L的樣本（陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為60 ng/ L），有6例PCR陰性，其中＞600 ng/L的2份標(biāo)本PCR和IgM 抗體均為陰性，與部分文獻(xiàn)報(bào)道的PCP患者(1，3)-β-D 葡聚糖檢測(cè)具有較好的靈敏度和特異度不相符[19]，原因可能包括：① (1，3)-β-D 葡聚糖特異性偏低，易受到真菌感染的干擾[22]，在研究制定入選標(biāo)準(zhǔn)時(shí)文獻(xiàn)排除了真菌感染干擾，而本研究病例則未排除；② 高危組例數(shù)偏少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步分析，且所用試劑盒品牌和陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)均與其他研究不同。結(jié)合臨床資料分析顯示，6例IgM抗體和PCR均陽(yáng)性患者中4例有PCP臨床癥狀，并且從六亞甲基四胺銀（GMS）染色標(biāo)本中找到肺孢菌，其余9例PCR陽(yáng)性，而IgM抗體陰性患者只有2例從GMS染色標(biāo)本檢出肺孢 菌。

綜上所述，Msg C共有抗原IgM 抗體聯(lián)合血清學(xué)指標(biāo)(1，3)-β-D葡聚糖檢測(cè)對(duì)PCP診斷具有一定的價(jià)值，兩者均為陽(yáng)性時(shí)應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行下呼吸道標(biāo)本PCR和傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)染色檢查。