吳彬嫻，林展拓，高志明,2，楊 楠,2，方亞鵬,2,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

β-胡蘿卜素通常存在植物體和一些動物體內(nèi)[1]，其分子式為C40H56，相對分子質(zhì)量為536.88，由11 個共軛雙鍵和2 個β-紫羅酮環(huán)組成，在食品中常作為色素使用[2]。但由于β-胡蘿卜素自身不溶于水，并且對光、氧、熱敏感，其在食品工業(yè)中的應(yīng)用受到極大的限制[3-4]。

β-胡蘿卜素的分子結(jié)構(gòu)對其顯色起著重要作用。其分子中的碳碳雙鍵是一種發(fā)色團(tuán)，當(dāng)分子內(nèi)有2 個或2 個以上的發(fā)色團(tuán)共軛時，其對光的吸收波長可移到可見光區(qū)。另外，β-胡蘿卜素的顯色性也與其在食品中存在的顆粒大小、順反異構(gòu)體的含量以及晶型密切相關(guān)[5]。根據(jù)順反異構(gòu)的類型及含量不同，β-胡蘿卜素可表現(xiàn)為黃色、橘色或紅色，在波長400～500 nm處有最大吸收峰。相關(guān)研究表明，在膠體顆粒中，β-胡蘿卜素有2 種存在形式，H型聚合體和J型聚合體[6-9]。單純的H型聚合是由4 個β-胡蘿卜素分子平行排列形成，這種排列形式的吸收光譜會發(fā)生約44 nm的藍(lán)移；而J型聚合是指β-胡蘿卜素分子呈人字形或首尾相連的排列聚集[10]，這種排列形式的吸收光譜會發(fā)生約44 nm的紅移或7 nm的藍(lán)移。另外，顆粒在體系中的粒徑分布不同，導(dǎo)致顆粒在體系中對光的吸收和散射不同。當(dāng)顆粒粒徑（r）遠(yuǎn)小于光的波長時（2πr/λ＜＜1），光的散射符合瑞利散射，即光散射強(qiáng)度變小，顏色的亮度降低，隨顆粒的粒徑逐漸增大，色彩的飽和度會下降，顏色變暗[11-13]。隨顆粒的粒徑進(jìn)一步增大（2πr/λ≥1），光的散射符合米氏散射，短波長的光發(fā)生散射，散射光的強(qiáng)度與光的波長之間的關(guān)系不再顯著。體系的顏色主要受顆粒的比表面積和其對光的吸收影響。

食品體系實(shí)際上屬于膠體體系，其具有多相、多組分、多尺度的特性。多數(shù)情況下，食品體系處于亞穩(wěn)態(tài)，易發(fā)生聚集、沉降、絮凝等現(xiàn)象，并由此導(dǎo)致食品的顏色、質(zhì)構(gòu)、口感的變化[14-17]。本實(shí)驗(yàn)在親水環(huán)境中制備不同粒徑的β-胡蘿卜素顆粒，研究不同粒徑分散體系的吸光和顯色性的區(qū)別。通過卡拉膠凝膠固化，使不同粒徑的β-胡蘿卜素顆粒分散體系得以穩(wěn)態(tài)化，為其作為食品著色劑的應(yīng)用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-胡蘿卜素（純度93%） 浙江醫(yī)藥股份有限公司；Gelcarin GP-911NF κ-卡拉膠 美國FMC公司；吐溫80（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VCX800超聲波細(xì)胞粉碎儀 美國Sonics公司；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；PT-MR 2011型高速剪切乳化機(jī) 瑞士Kinematica公司；LGJ-12型冷凍干燥機(jī) 鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；CM3500d型色度儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司；BT-1600型光學(xué)顯微鏡 丹東百特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-胡蘿卜素的超聲分散及表征

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的β-胡蘿卜素粉末加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的吐溫80溶液中，冰水浴超聲分散10 min，防止超聲過熱致使β-胡蘿卜素降解。每隔1 min定時取樣進(jìn)行粒徑分析和其他表征。超聲功率設(shè)置為40%（總功率800 W），系統(tǒng)運(yùn)行和間隔時間設(shè)置為1 s。

經(jīng)超聲分散的β-胡蘿卜素膠體顆粒的形貌采用透射電子顯微鏡觀察。將β-胡蘿卜素分散液用去離子水稀釋至0.05%，取10 μL稀釋液滴于銅網(wǎng)上，待水分揮發(fā)后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，揮干后在透射電子顯微鏡下觀察。

取β-胡蘿卜素分散液200 μL加4 800 μL去離子水稀釋后于TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計(jì)中進(jìn)行全波段掃描以探究不同粒徑β-胡蘿卜素在體系中的特征吸收峰的區(qū)別。以不添加β-胡蘿卜素的稀釋液為空白對照，波長寬度1 nm，慢速掃描，波長范圍為200～900 nm進(jìn)行全波長掃描。

粒徑在25 ℃條件下測量，取β-胡蘿卜素分散液200 μL加4 800 μL去離子水后搖勻，吸取1 mL的稀釋液于樣品池中。每個樣品測量3 次并取平均值。

1.3.2 β-胡蘿卜素膠體分散體系的制備及表征

在85 ℃條件下將超聲后的β-胡蘿卜素分散液以體積比1∶10加入到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.2%～1.2%）的卡拉膠溶液（含0.1 mol/L KCl）中混合均勻，然后置于冰水中冷卻，以體系無法自由流動為準(zhǔn)，直到體系完全凝固。采用高速剪切將含有β-胡蘿卜素膠體顆粒的凝膠在2 000 r/min轉(zhuǎn)速下剪切粉碎，使體系中無肉眼可見的大塊凝膠以便凍干。經(jīng)凍干后得到含有β-胡蘿卜素的固體粉末，粉末主要由卡拉膠和β-胡蘿卜素組成，且含有少量的KCl。

采用光學(xué)顯微鏡觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)。將凍干后的β-胡蘿卜素凝膠粉末分散于去離子水中，取少量分散液置于載玻片上進(jìn)行微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3.3 色值分析

將凍干后的β-胡蘿卜素膠體分散體系的粉末復(fù)溶后在柯尼卡美能達(dá)CM3500d型色度儀上進(jìn)行透射光譜和L*、a*、b*值測定。其中透射光譜測定波長范圍為350～750 nm。運(yùn)用D65觀察視場下測定CIE色度空間中的色度坐標(biāo)L*、a*、b*值和透光率。

1.3.4 穩(wěn)定性分析

將凍干的膠體粉末復(fù)溶為1%的分散液置于室溫條件下進(jìn)行不避光、不除氧貯藏，每1 d測定β-胡蘿卜素含量。取1 mL膠體分散液于離心管中，加入6 mL正己烷振蕩萃取。靜置待混合物分層后取上層清液在波長450 nm處測定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Orign 8.0軟件進(jìn)行分析。通過BT-1600圖像顆粒分析系統(tǒng)觀察復(fù)溶后的膠體分散體系粉末。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲對β-胡蘿卜素膠體顆粒形貌的影響

如圖1所示，超聲時間為1 min時（圖1A），β-胡蘿卜素在吐溫80溶液中呈塊狀，且顆粒形狀各異、大小不一。但β-胡蘿卜素晶體的微觀特征清晰可見，呈現(xiàn)出細(xì)條狀紋路。超聲時間為5 min時（圖1B），分散體系中大部分β-胡蘿卜素呈均勻的球狀顆粒，且粒徑變小。而在水中超聲5 min后（圖1C）的β-胡蘿卜素顆粒較大，且尺寸不一，在放置過程中顆粒極易聚集而產(chǎn)生沉降。說明超聲能使β-胡蘿卜素在水相中形成納米顆粒，但由于較強(qiáng)的表面疏水性，這種顆粒在水相中容易發(fā)生聚集。而吐溫80能與β-胡蘿卜素顆粒間通過疏水相互作用從而有效阻止其疏水聚集[18]。

圖1 超聲處理后β-胡蘿卜素顆粒的透射電子顯微鏡圖Fig. 1 TEM of β-carotene particles after ultrasonication

2.2 超聲對β-胡蘿卜素膠體顆粒的粒徑和顯色性的影響

圖2 不同超聲時間β-胡蘿卜素分散液粒徑（A）、粒徑分布（B）、外觀（C）和紫外-可見全波段掃描（D）Fig. 2 Changes in particle size and color properties of β-carotene dispersions during ultrasonication

如圖2A所示，隨超聲處理時間的延長，β-胡蘿卜素的粒徑逐漸減小，并在5 min后趨于穩(wěn)定，此時的粒徑約為（164±1）nm。從圖2B可以看出，隨著超聲處理時間延長，β-胡蘿卜素的粒徑分布主峰由較大粒徑向較小粒徑方向逐漸移動，并在5 min后趨于穩(wěn)定。與圖2A所呈現(xiàn)的趨勢一致。綜合兩圖，β-胡蘿卜素顆粒在超聲處理5 min后其在水相中的分散性達(dá)到穩(wěn)定。

如圖2C所示，隨著超聲時間延長，β-胡蘿卜素的外觀顏色先逐漸由橙紅色變?yōu)槌赛S色（1～5 min），后隨著超聲時間的進(jìn)一步延長，色澤變化不再明顯（5～10 min）。

如圖2D所示，所有樣品均在330～350 nm處有最大吸收峰，此處吸收峰為β-胡蘿卜素順式異構(gòu)體所致；隨著超聲處理時間延長，粒徑變小，β-胡蘿卜素特征吸收峰（400～500 nm）逐漸增高；535 nm為結(jié)晶型β-胡蘿卜素的吸收峰。這可能是由于結(jié)晶型的β-胡蘿卜素是以全反式異構(gòu)體為主，而無定型的β-胡蘿卜素以順式異構(gòu)體為主[19]。在本體系中，隨粒徑減小，β-胡蘿卜素特征吸收峰（450 nm左右）出現(xiàn)藍(lán)移。分散體系中顆粒的大小在一定程度上也可以影響體系的色澤，根據(jù)Kubelka-Munk[20-22]理論，當(dāng)顆粒的粒徑足夠小時，光散射減小，體系的明亮程度也會降低。這也是超聲導(dǎo)致色澤改變的原因之一。

2.3 卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)對β-胡蘿卜素分散體系穩(wěn)定性的影響

圖3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)卡拉膠穩(wěn)定的β-胡蘿卜素分散顆粒凝膠、粉末及復(fù)溶后（A）和微觀形貌（B）Fig. 3 Appearance (A) and microstructure (B) of β-carotene colloids stabilized with different concentrations of kappa-carrageenan

卡拉膠凝膠形成過程中，其分子之間通過交聯(lián)而形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[23-27]。本研究利用這一原理，將超聲形成的β-胡蘿卜素顆粒固定在卡拉膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，防止其發(fā)生進(jìn)一步聚集沉降，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)態(tài)化?？ɡz質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，其形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越致密[23]，其對β-胡蘿卜素的穩(wěn)定能力有所不同。由圖3A可知，卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.6%以下時，凝膠網(wǎng)絡(luò)較為稀疏，β-胡蘿卜素顆粒不能被很好地穩(wěn)定，復(fù)溶前后顏色差別較大。當(dāng)卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.8%以上時，β-胡蘿卜素顆粒能夠被較好地穩(wěn)定。從圖3B能夠看出，卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時（＜0.6%），在靜置的過程中β-胡蘿卜素顆粒發(fā)生聚集和沉降，其在顯微鏡下表現(xiàn)為大塊的β-胡蘿卜素顆粒不均勻地分散于體系中。如圖3B中箭頭所指的黑色顆粒即為在靜置過程中發(fā)生了聚集的β-胡蘿卜素顆粒，當(dāng)卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%時，視野中可見較大塊的β-胡蘿卜素顆粒；隨著卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，視野中可見的β-胡蘿卜素顆粒逐漸變少。當(dāng)卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（0.8%～1.2%）時，β-胡蘿卜素顆粒均勻分散在凝膠體系中，未見明顯聚集顆粒。同時，視野中可見半透明的卡拉膠凝膠，說明高質(zhì)量分?jǐn)?shù)卡拉膠凝膠對β-胡蘿卜素顆粒具有較好的穩(wěn)定效果。

2.4 β-胡蘿卜素膠體分散體系的色值分析

圖4 不同超聲時間的膠體分散體系復(fù)溶后的色值分析Fig. 4 Color properties and appearance of re-dispersed β-carotene colloids

如圖4A所示，在400～500 nm波長范圍內(nèi)，隨超聲時間延長（β-胡蘿卜素顆粒粒徑減?。z體分散體系的分光透過率減小。說明在此波長范圍內(nèi)，體系對光的吸收隨粒徑減小而增大，這與全波長掃描圖譜的結(jié)果一致。此外，隨超聲時間的延長，顆粒粒徑減小，顆粒表面的分子數(shù)的比表面積增大，體系的透光率就會減小[22]。如圖4B所示，體系的L*值隨粒徑的變小而變低，這可能是由于光散射強(qiáng)度隨粒徑減小而變小造成的。光散射強(qiáng)度越弱，體系對光的反射越弱，體系顏色更暗、顏色變深。同樣通過a*、b*值可以發(fā)現(xiàn)，體系a*、b*值隨粒徑減小而增大，體系顏色向紅光、黃光方向偏移。在圖4C可以明顯看出，體系的顏色逐漸由淡紅變?yōu)殚偌t。這與β-胡蘿卜素分散液（未被卡拉膠凝膠穩(wěn)定時，圖2C）的外觀變化趨勢一致。

2.5 β-胡蘿卜素穩(wěn)定性分析

圖5 不同超聲時間的膠體分散體系復(fù)溶后的貯藏穩(wěn)定性Fig. 5 Stability of β-carotene dispersions with different ultrasonication times during storage

如圖5所示，β-胡蘿卜素膠體分散體系中β-胡蘿卜素的降解速率隨其粒徑降低而加快。β-胡蘿卜素的降解通常受諸多因素影響，如貯藏溫度、pH值和離子強(qiáng)度等[28-29]。除此之外，與β-胡蘿卜素所處體系的多孔性和水分活度也密切相關(guān)。當(dāng)體系的孔隙較小，孔隙壁較薄時，β-胡蘿卜素更易于暴露于更多的氧中，從而加速了β-胡蘿卜素的降解[30]。本實(shí)驗(yàn)體系中采用了相同的卡拉膠凝膠穩(wěn)定β-胡蘿卜素顆粒，因此影響體系中β-胡蘿卜素降解速率的因素主要為粒徑。由于卡拉膠凝膠時形成了空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離子和氧等可以較為自由地在體系中運(yùn)動，且β-胡蘿卜素比較均勻地分散在體系中，粒徑較小的β-胡蘿卜素顆粒比粒徑較大的β-胡蘿卜素顆粒具有更大的比表面積，小顆粒的β-胡蘿卜素比大顆粒的β-胡蘿卜素接觸到更多的氧、離子和光，在貯藏的過程中，氧化更快。但在工業(yè)化應(yīng)用的過程中，可適量添加抗氧化劑（如VC、VE）防止β-胡蘿卜素的氧化。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過不同超聲時間得到了不同粒徑的β-胡蘿卜素顆粒，并對其顯色性進(jìn)行了表征。進(jìn)一步采用卡拉膠凝膠對β-胡蘿卜素顆粒進(jìn)行穩(wěn)定，得到了適合添加至食品中的β-胡蘿卜素膠體分散體系。隨超聲時間的延長，β-胡蘿卜素顆粒的粒徑減小，其顏色由紅色向橘色轉(zhuǎn)變，亮度降低。較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的卡拉膠凝膠（＞0.8%）能對β-胡蘿卜素顆粒起到穩(wěn)態(tài)化的效果。隨著β-胡蘿卜素顆粒粒徑的減小，其在凝膠中的降解速率增加。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，食品體系的顏色不僅可以通過著色劑的種類、濃度來改變，也可以通過對著色劑的形態(tài)、粒徑的調(diào)控來改變。