馬燕紅，王 妍，李志剛，李瑩瑩，郭文萍

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

近幾十年來抗生素，尤其是β-內(nèi)酰胺類抗生素，由于其在人類醫(yī)學(xué)和獸藥學(xué)上有效地預(yù)防和治療各種傳染性疾病而備受關(guān)注。青霉素屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，由于其藥效高、價格低廉、使用方便，已成為臨床上治療細(xì)菌感染最常用的抗生素，在畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。目前主要用于治療奶牛乳腺炎、魚、蝦細(xì)菌感染和海參的疾病[1]。然而，用藥不規(guī)范對漁業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境都有嚴(yán)重的潛在危害，也會導(dǎo)致藥物在奶和動物、水產(chǎn)品組織中的殘留，使人體產(chǎn)生耐藥性導(dǎo)致免疫力降低，也會使過敏個體存在潛在的風(fēng)險，從而危害人體健康[2]。同時，抗生素殘留也成為國際貿(mào)易的壁壘[3]。我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定芐星青霉素在動物源組織中的限量值為50 μg/kg、苯唑西林為300 μg/kg，歐盟指令NO.2377/90/EEC對青霉素類抗生素在動物源性食品中的殘留進(jìn)行了嚴(yán)格限制。所以對動物源性食品中此類抗生素殘留的有效監(jiān)測已經(jīng)成為保障食品安全的一個重要環(huán)節(jié)。為滿足殘留檢測的需要，建立一種動物源性食品中青霉素類抗生素殘留的分析方法非常重要。

青霉素類藥物殘留的檢測方法一直以來都是科研人員關(guān)注的熱點，目前已報道的方法主要有微生物法[4]、免疫分析法[5-6]、近紅外光譜法[7]、拉曼光譜法[8]、高效液相色譜-紫外法[9-13]、高效液相色譜-熒光法[14]、高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光法[15]、液相色譜-質(zhì)譜法[16-19]、電泳法[20]等。其中，微生物法操作快速簡便、價格便宜，但專屬性不足，容易產(chǎn)生假陽性；免疫分析法由于要選擇配體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，線性范圍窄，在檢測過程中也易產(chǎn)生假陽性；光譜法在定量方面存在缺陷；液相色譜-質(zhì)譜法可避免生物法在準(zhǔn)確性方面的欠缺，靈敏度高、選擇性強，但由于儀器價格昂貴，不能滿足絕大多數(shù)實驗室的需求。高效液相色譜法成為這類藥物殘留應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)，其準(zhǔn)確性強、靈敏度高，能滿足青霉素類藥物殘留的痕量檢測需求。

本實驗旨在建立一種動物源性食品中青霉素G、苯唑西林、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素4 種青霉素類藥物的高效液相色譜檢測方法。采用乙腈-水提取目標(biāo)化合物，HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜法對不同基質(zhì)中4 種青霉素類藥物進(jìn)行測定，并驗證了所建方法的選擇性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和靈敏性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青霉素G鉀鹽（純度99.6%）、苯唑西林（純度91.0%）、乙氧萘青霉素（純度99.0%）、雙氯青霉素（純度97.5%）、水合氨芐青霉素（純度98.5%）德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；乙腈、甲醇（HPLC級） 美國Fisher公司；乙酸銨（色譜純） 北京Dikma公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 Infinity高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）、C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）美國安捷倫公司；SCR20BA離心機 日本日立公司；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg，3 mL）、C18固相萃取柱（500 mg，3 mL） 美國Waters公司；HGC-36A氮吹儀天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取青霉素G、苯唑西林、乙氧萘青霉素和雙氯青霉素的標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確到0.000 1 g）于10 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的青霉素G、苯唑西林、雙氯青霉素和乙氧萘青霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于4 ℃以下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別量取青霉素G、苯唑西林、雙氯青霉素和乙氧萘青霉素質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液各1.00 mL于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的4 種青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃以下避光保存。

內(nèi)標(biāo)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取水合氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確到0.000 1 g）于10.0 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的水合氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于4 ℃以下避光保存。

內(nèi)標(biāo)工作液的配制：量取1.00 mL 1.00 mg/mL水合氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的水合氨芐青霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 高效液相色譜條件

C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序：0.00～3.00 min，87% A；3.01～10.0 min，87%～65% A；10.01～15 min，65%～87% A。流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃；紫外檢測波長210 nm。

1.3.3 樣品前處理

提取：準(zhǔn)確稱取切碎均質(zhì)良好的樣品2.00 g于50 mL離心管中，加內(nèi)標(biāo)工作液20 μL，靜置10 min，先加入2 mL水，再加入20 mL乙腈，渦旋混勻30 s，振蕩提取15 min，12 000 r/min離心5 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中，向殘渣中再加水1 mL、乙腈10 mL渦旋混勻，二次提取，將上清液全部轉(zhuǎn)移到旋蒸瓶中。在旋蒸瓶中加入0.1 mL飽和食鹽水，于45 ℃水浴旋蒸至近干，加入3 mL正己烷，渦旋混勻，除去上層正己烷，剩余液體為固相萃取上樣液。

換熱站供熱節(jié)能改造工程一般包括以下內(nèi)容：（1）加裝或更換一次網(wǎng)控制閥、熱量表、遠(yuǎn)傳水表和電表，將換熱站內(nèi)熱、水、電的能源消耗情況進(jìn)行獨立的統(tǒng)計，建立能耗統(tǒng)計和分析系統(tǒng)，監(jiān)測換熱站的能耗情況，并制定運行調(diào)整方案。（2）二次管網(wǎng)加裝電動或手動平衡閥，通過其調(diào)節(jié)性能，提高二次管網(wǎng)的輸配效率，同時消除管網(wǎng)末端供暖質(zhì)量問題，減少因供暖質(zhì)量引起的人為放水。（3）站內(nèi)水泵變頻和PLC控制柜改造，完善站內(nèi)自動控制系統(tǒng)，增加水泵、閥門的運行調(diào)節(jié)方式，加裝或利用站內(nèi)原有溫度、壓力測點進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。實現(xiàn)一次網(wǎng)閥門多控制方式選擇，同時滿足上位系統(tǒng)調(diào)整需求。典型換熱站節(jié)能改造示意圖如圖1所示。

凈化：將上樣液轉(zhuǎn)移到HLB固相萃取柱中（使用前用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL pH 8.5的磷酸鹽緩沖液活化），再用3 mL磷酸鹽緩沖液洗滌雞心瓶2 次，洗液一并轉(zhuǎn)移到萃取柱中；再用3 mL水淋洗并抽干萃取柱，用2 mL甲醇＋2 mL乙腈洗脫并收集于5 mL帶刻度的玻璃瓶中，50 ℃氮吹至小于1 mL，用乙腈定容至1 mL，渦旋混合，過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜分析。對每一個待測樣品平行測定3 次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（ANOVA），數(shù)據(jù)以 ±s表示，P＜0.05，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

由于青霉素類化合物在弱酸性條件下易水解，水解產(chǎn)物中含有巰基、羰基等，易與金屬離子形成絡(luò)合物，國標(biāo)[21]和文獻(xiàn)[22]因此采用衍生化法測定此類化合物。但會用到氯化汞等毒性物質(zhì)，操作也較為復(fù)雜。而青霉素類化合物是β-內(nèi)酰胺類，具有苯環(huán)、羰基等發(fā)色基團(tuán)，在紫外波長范圍內(nèi)有吸收峰。故本實驗采用直接進(jìn)樣法檢測這類化合物。

青霉素類藥物由于具有不穩(wěn)定的四元環(huán)，易發(fā)生反應(yīng)。用外標(biāo)法測定時，回收率較低，故本實驗選取性質(zhì)接近的水合氨芐青霉素作為內(nèi)標(biāo)物用以提高回收率。

本實驗在大量文獻(xiàn)和前期工作的基礎(chǔ)上，對比乙腈-水、乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液和乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動相，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出峰的半峰寬、分離度、保留因子等參數(shù)情況。結(jié)果表明：采用乙腈-水為流動相進(jìn)行實驗時，溶劑峰嚴(yán)重拖尾，且化合物不出峰，原因可能是流動相中不含鹽，與固定相無保留；在流動相中加入鹽后，化合物與固定相作用，可以正常出峰，但乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液為流動相時，色譜峰的半峰寬大于乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相時的峰寬；加大鹽的濃度，峰形變窄，變尖。但考慮到鹽濃度增大在色譜柱中易結(jié)晶，影響色譜柱壽命，本實驗選取乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液作為流動相。

以不同體積比的0.02 mol/L磷酸二氫鉀-乙腈溶液作為流動相，考察4 種青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間。流動相比例為0.02 mol/L磷酸二氫鉀-乙腈（70∶30，V/V）溶液等度洗脫，在12 min內(nèi)可完成分離，如圖1A所示。但內(nèi)標(biāo)峰水合氨芐青霉素在2.6 min左右出峰，青霉素G出峰時間在3.8 min左右，出峰時間較早。因動物源食品成分復(fù)雜，可能會對水合氨芐青霉素、青霉素G的分析產(chǎn)生干擾。因此本實驗選取梯度洗脫，洗脫程序如1.3節(jié)所述，分離效果圖見圖1B。出峰順序依次為水合氨芐青霉素、青霉素G、苯唑西林、乙氧萘青霉素和雙氯青霉素。

圖1 等度洗脫（A）和梯度洗脫（B）色譜圖Fig. 1 Chromatograms obtained by isocratic elution (A) and gradient elution (B)

2.2 提取條件的選取

2.2.1 提取溶劑的選擇

參照文獻(xiàn)方法，本實驗比較了乙腈[23]、乙腈-水（10∶1，V/V）[24]、乙腈-水（4∶1，V/V）[19]、丙酮-水（1∶1，V/V）[25]作提取溶劑，其他條件如1.3.3節(jié)所述，加標(biāo)量在50 μg/kg時的回收率，結(jié)果見圖2。用乙腈和乙腈-水（10∶1，V/V）作提取溶劑時，回收率均在90%左右，后者回收率略高，其他2 組回收率較低?？赡苁怯捎谝译嫣崛r沉淀蛋白完全，易于離心分離，提前加入水能先溶解目標(biāo)化合物。故本實驗選取乙腈-水（10∶1，V/V）作為提取溶劑。減壓蒸餾過程中加入飽和食鹽水，可以防止乙腈在旋蒸過程中暴沸[24]。

2.2.2 SPE柱的選擇

由于動物源性食品基質(zhì)復(fù)雜，選用SPE凈化小柱獲得較好的凈化效果。青霉素類化合物分子中含有羥基，顯酸性，易溶于甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑。文獻(xiàn)中廣泛采用的是。本實驗比較了這2 種SPE柱在相同條件下的回收率。加標(biāo)量為50 μg/kg，3 mL甲醇、3 mL水活化，上樣，水淋洗后抽干，最后用2 mL甲醇+2 mL乙腈洗脫，N2吹干后乙腈復(fù)溶。如圖3所示，HLB柱對目標(biāo)化合物的回收率均高于C18柱，與文獻(xiàn)[24-25]報道結(jié)果一致。

圖3 不同SPE柱的回收率Fig. 3 Effect of different SPEs on recovery of penicillins

2.2.3 SPE洗脫條件的優(yōu)化

不同的淋洗和洗脫溶劑也影響了SPE柱的凈化效果。本實驗在文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，比較不同的淋洗和洗脫溶劑對回收率的影響，如表1所示。

表1 SPE洗脫條件的優(yōu)化Table 1 Optimization of SPE conditions

從表1可以看出，洗脫液為2 mL甲醇+2 mL乙腈時，4 種化合物的回收率明顯提高。當(dāng)在活化和淋洗劑中加入堿性磷酸緩沖鹽時，回收率達(dá)到了90%左右?？赡苁菈A性磷酸鹽緩沖液防止待測物降解[12]。最終確定SPE萃取小柱的最佳條件為：選取HLB萃取柱，采用方案4的方式凈化。

2.3 方法的驗證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限結(jié)果

配制質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00 μg/mL 6 個水平4 種青霉素的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，含內(nèi)標(biāo)0.20 μg/mL，待高效液相色譜分析。每個溶液分別進(jìn)樣3 次，以目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度之比對其峰面積之比繪制4 種青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中X為青霉素與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度比，Y為二者峰面積之比。從表2可以看出，各目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999，顯示了良好的相關(guān)性。檢出限和定量限采用空白樣品中添加青霉素類化合物的方法，分別以信噪比不小于3和信噪比不小于10計算。從表2可以看出，各青霉素的檢出限為3 μg/kg，定量限為10 μg/kg，可以滿足青霉素類化合物的定性及定量測定要求。

表2 4 種青霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, calibration curves, LODs and LOQs for four penicillins

2.3.2 精密度測定結(jié)果

在空白豬肉樣品中進(jìn)行精密度實驗，樣品添加不同含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，渦旋混勻，于室溫放置10 min，使待測成分與樣品機體成分互相作用達(dá)到平衡，按1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)所述方法，做6 次重復(fù)實驗，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)。

表3 精密度實驗（n=6）Table 3 Results of precision test (n=6)

2.3.3 回收率測定結(jié)果

在空白樣品中分別加入低、中、高3 個質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率計算，選擇分別加入10、50、200 μg/kg 4 種青霉素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，利用上述確定的檢測方法，每個加標(biāo)量做3 次平行實驗。由表4可知，在不同的基質(zhì)中，3 個水平的回收率在69.9%～100.3%范圍內(nèi)。從精密度和回收率的結(jié)果可以得出，該方法有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

表4 4 種青霉素低、中、高3 個水平的回收率Table 4 Recovery rates for four penicillins at three different spiked levels

2.3.4 實際樣品驗證

從市場中選取5 種基質(zhì)進(jìn)行方法驗證，分別為豬肉、牛肉、羊肉、雞肉、草魚，目標(biāo)化合物出峰處均無干擾、未檢測出4 種青霉素類藥物殘留。

3 結(jié) 論

本實驗以水合氨芐青霉素作為內(nèi)標(biāo)，建立一種高效液相色譜法檢測動物源性食品中的青霉素G鉀鹽、苯唑西林、乙氧萘青霉素、雙氯青霉素4 種青霉素類藥物殘留量的方法。采用直接進(jìn)樣，無需衍生化，內(nèi)標(biāo)法定量提高了回收率。該方法前處理簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可以滿足實際檢測分析的需要。