伊冠東，劉蘭香，雷福厚，張加研，李 凱，鄭 華，張 弘，孫彥琳,*

（1.昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650500；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所，云南 昆明 650224；3.廣西民族大學(xué) 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006；4.西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650224）

紫膠紅色素來(lái)源于紫膠蟲(chóng)的新陳代謝產(chǎn)物[1-2]，是一種被多個(gè)國(guó)家允許用于食品添加的天然色素[3]，同時(shí)被廣泛運(yùn)用在棉、羊毛、紡織品等的染色[4-5]。紫膠紅色素的主要染色成分是紫膠色酸混合物，主要含有A、B、C、D、E 5 種組分，其中紫膠色酸A占總質(zhì)量的85%左右，它們均屬于蒽醌類(lèi)化合物[6-8]（圖1）。蒽醌及其衍生物由于具有較好的平面及共軛結(jié)構(gòu)，大多可發(fā)射熒光，被廣泛用來(lái)識(shí)別不同體系中多種金屬離子或其他陰離子[9-10]。紫膠紅色素已被證明具有熒光性[6]，然而，化學(xué)結(jié)構(gòu)確定的單一成分紫膠色酸的熒光性質(zhì)還鮮見(jiàn)有關(guān)報(bào)道。另外，目前檢測(cè)食品、化妝品等樣品中天然色素的常用方法有毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，而檢測(cè)食品中紫膠紅色素方法的相關(guān)報(bào)道很少見(jiàn)[11-12]。因此，為滿足食品安全發(fā)展的需要，開(kāi)發(fā)快速、靈敏、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中紫膠紅色素的方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

另一方面，金屬元素廣泛存在于自然界中，它們與生命體的生理活動(dòng)有著密不可分的聯(lián)系，當(dāng)人體中攝入的某種元素過(guò)少或過(guò)多時(shí)都會(huì)影響身體健康[13-16]。因此，開(kāi)發(fā)快速、便捷的檢測(cè)金屬離子方法，在食品[17-18]、環(huán)境[19]、化學(xué)、生命科學(xué)[8]等領(lǐng)域具有重要意義。熒光探針?lè)╗20-22]具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、及時(shí)性及簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，在金屬離子檢測(cè)研究中受到了密切關(guān)注[23]。

本實(shí)驗(yàn)考察紫膠色酸A的熒光及吸收光譜的基本性質(zhì)和影響因素，探索紫膠色酸A對(duì)金屬離子的識(shí)別作用，期望將紫膠色酸A開(kāi)發(fā)為檢測(cè)某種特定金屬離子的熒光分子探針，同時(shí)開(kāi)發(fā)一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)紫膠色酸A的方法，為紫膠紅色素的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)，預(yù)期了紫膠紅色素更加廣泛的應(yīng)用特性和市場(chǎng)前景。

圖1 紫膠色酸A的分子結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Molecular structure of laccaic acid A

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海之言果味飲料。紫膠紅色素及紫膠色酸A（≥95%）由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲(chóng)研究所提供；鹽酸、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、正丁醇、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、硝酸銀及其他金屬無(wú)機(jī)鹽（氯化鹽）（均為分析純） 廣東光華科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-4600熒光光譜儀 日本Hitachi公司；Cary Series紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀 美國(guó)Agilent Technologies公司；WD-9403C紫外儀 北京六一生物科技有限公司；AB204-型精密電子天平 梅特勒-托利多（中國(guó)）有限公司；CPC-505臺(tái)式pH計(jì) 歐洲Elmetron公司；TY742X2A型純水機(jī) 美國(guó)Barnstead公司。

1.3 方法

1.3.1 一般光譜測(cè)定方法

熒光光譜測(cè)定時(shí)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為380 nm，狹縫寬度為10 nm，掃描速率為12 000 nm/min，光電倍增管電壓為950 V。紫外-可見(jiàn)吸收光譜全波長(zhǎng)掃描過(guò)程中掃描速率為600 nm/min。

1.3.2 溶劑的影響

將2.7 mg紫膠色酸A分別溶于體積為25.0 mL的水、甲醇、乙醇、正丁醇、DMF、DMSO溶劑中，配成濃度為2×10－4mol/L的紫膠色酸A溶液，室溫超聲10 min后分別進(jìn)行光譜測(cè)定。

1.3.3 紫膠色酸A濃度的影響

稱(chēng)取107.5 mg的紫膠色酸A溶于50.0 mL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，配成濃度為4.0×10－3mol/L的紫膠色酸A儲(chǔ)備液，然后逐級(jí)稀釋至不同濃度（2.0×10－3～2×10－6mol/L）作為待測(cè)樣品溶液備用，考察紫膠色酸A濃度對(duì)其光譜性質(zhì)的影響。

1.3.4 pH值的影響

分別制備0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH儲(chǔ)備溶液，然后將溶液適當(dāng)稀釋至所需pH值并用pH計(jì)校正。稱(chēng)取2.7 mg的紫膠色酸A溶于25.0 mL上述不同pH值的稀釋液中，配成濃度為2.0×10－4mol/L的紫膠色酸A溶液，室溫超聲10 min，考察pH值不同的HCl和NaOH溶液對(duì)紫膠色酸A光譜性質(zhì)的影響。

1.3.5 紫膠色酸A對(duì)金屬離子的選擇性識(shí)別

稱(chēng)取紫膠色酸A溶于75%乙醇溶液中，配成濃度為2.0×10－4mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別取5.0 mL紫膠色酸A乙醇溶液與1.0 mL金屬離子（4.0×10－3mol/L）溶液混合于離心管中，混合均勻后靜置20 min，然后測(cè)定熒光強(qiáng)度，考察金屬離子對(duì)紫膠色酸A的熒光影響。

1.3.6 抗干擾性實(shí)驗(yàn)

將紫膠色酸A溶于75%乙醇溶液，配成濃度為2.0×10－4mol/L的樣品溶液，將5.0 mL紫膠色酸A溶液和1.0 mL Al3+（4×10－3mol/L）溶液混合于離心管中，然后再分別加入1.0 mL濃度為4.0×10－3mol/L的其他金屬離子溶液，混合均勻后測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

1.3.7 Zn2+或 Al3+濃度與紫膠色酸A熒光強(qiáng)度的關(guān)系

配制濃度為0.1 mol/L的Zn2+或Al3+儲(chǔ)備液，并將其逐級(jí)稀釋至不同濃度（8.0×10－2～1.0×10－4mol/L）待用，然后將5.0 mL濃度為2.0×10－4mol/L的紫膠色酸A的75%乙醇溶液和1.0 mL不同濃度的Zn2+或Al3+混合均勻后檢測(cè)熒光，考察Zn2+或 Al3+濃度與紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度的關(guān)系。

1.3.8 Al3+存在下紫膠色酸A濃度與其熒光強(qiáng)度的關(guān)系

將紫膠色酸A溶于75%的乙醇溶液中，配成濃度為4.0×10－3mol/L的儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋至不同濃度（2.0×10－3～1.0×10－6mol/L）作為待測(cè)樣品備用。配制濃度為0.04 mol/L的Al3+溶液備用。取5.0 mL不同濃度的紫膠色酸A溶液于離心管中，分別加入1.0 mL Al3+溶液，混合均勻后測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度并繪制工作曲線。

1.3.9 實(shí)際應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

配制濃度為0.04 mol/L 的AlCl3標(biāo)準(zhǔn)液；紫膠色酸A加入至飲料中配制成3.7×10－3mol/L的儲(chǔ)備液，然后用75%乙醇溶液稀釋至不同濃度作為待測(cè)樣品。取5.0 mL待測(cè)樣品于離心管中，分別加入1.0 mL Al3+標(biāo)準(zhǔn)液，混合均勻后測(cè)定溶液的熒光強(qiáng)度，將所得數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)方程，計(jì)算得到待測(cè)樣品中紫膠色酸A的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均平行處理3 次，結(jié)果以 ±s表示。各因素對(duì)紫膠色酸A熒光性質(zhì)的影響采用Origin 9.1數(shù)據(jù)分析軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑對(duì)紫膠色酸A光譜的影響

圖2 溶劑對(duì)紫膠色酸A的熒光（A）和吸收（B）光譜的影響Fig. 2 Fluorescence (A) and absorption (B) spectra of laccaic acid A in different solvents

如圖2所示，紫膠色酸A在不同的溶劑中其熒光強(qiáng)度由小到大的順序?yàn)椋核技状迹糄MSO＜正丁醇＜乙醇＜DMF。此外，紫膠色酸A的最大發(fā)射波長(zhǎng)與溶劑有關(guān)，在水和醇中發(fā)射波長(zhǎng)位于590 nm左右，在DMF和DMSO中發(fā)射波長(zhǎng)位于630 nm左右。隨著熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長(zhǎng)的變化紫膠色酸A在可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)（λmax）發(fā)生了改變，最小的是在水中，為488 nm；最大的是在DMF中，為501 nm。究其原因，水和醇屬于質(zhì)子性溶劑，它們與色酸分子容易形成氫鍵，有助于色酸分子聚集，而水是所考察的所有溶劑中極性最大的，色酸分子的親水性作用足以克服色酸陰離子之間的靜電斥力，從而使其熒光降低，因此，紫膠色酸A在水中的熒光強(qiáng)度最小。DMSO和DMF屬于非質(zhì)子性溶劑，它們與溶質(zhì)色酸分子容易發(fā)生溶劑化作用，同時(shí)，由于溶劑中存在S＝O或C＝O鍵，在色酸分子的熒光被激發(fā)時(shí)有助于π→π*躍遷，而DMF中的N原子具有孤對(duì)電子，加強(qiáng)了這種作用，因而紫膠色酸A在DMF中的熒光最強(qiáng)。由此可見(jiàn)，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度主要受溶劑本身的化學(xué)特性影響，其次，溶劑的極性也有一定程度的影響[24]。紫膠色酸A在水中的溶解度很小，在乙醇中的溶解度較大，而DMSO、DMF等有機(jī)溶劑有一定的毒性，因此，考慮到實(shí)際應(yīng)用，選擇乙醇-水混合體系作為溶劑較為合適，本實(shí)驗(yàn)選擇75%的乙醇溶液作溶劑。

2.2 紫膠色酸A濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

圖3 紫膠色酸A濃度對(duì)熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長(zhǎng)的影響Fig. 3 Effect of concentrations on the fluorescence intensity and emission wavelength of laccaic acid A

如圖3所示，當(dāng)紫膠色酸A濃度在2×10－6～2×10－4mol/L范圍內(nèi)，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長(zhǎng)均隨濃度的增大而增大，當(dāng)溶度為2×10－4mol/L時(shí)熒光最強(qiáng)，發(fā)射波長(zhǎng)從585 nm增大至598 nm；繼續(xù)增大紫膠色酸A的濃度，體系的熒光強(qiáng)度會(huì)急劇減小直至猝滅，發(fā)射波長(zhǎng)基本保持在600 nm左右。這可能是由于熒光分子在低濃度范圍內(nèi)聚集形成二聚體或多聚體是有助于熒光增強(qiáng)的，但是當(dāng)熒光分子濃度增大到一定程度，激發(fā)態(tài)的分子與處于基態(tài)的分子相互碰撞導(dǎo)致激發(fā)態(tài)分子失活的概率增大，熒光分子發(fā)生能量自吸收從而引起了熒光減弱甚至猝滅[25-26]。因此，探究紫膠色酸A的其他熒光性質(zhì)時(shí)，選擇其濃度為2.0×10－4mol/L。

2.3 pH值對(duì)紫膠色酸A熒光強(qiáng)度的影響

圖4 pH值對(duì)紫膠色酸A熒光強(qiáng)度（A）和吸收光譜（B）的影響Fig. 4 Fluorescence intensity (A) and absorption spectra (B) of laccaic acid A at different pH values

將紫膠色酸A溶解于pH值不同的水溶液中，當(dāng)溶液的pH值小于或等于3時(shí)，紫膠色酸A的溶解度很小，小于2×10－4mol/L，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度極低。如圖4所示，當(dāng)溶液的pH值在4～10之間，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度受pH值的影響較小，幾乎保持不變，吸收光譜也沒(méi)有明顯差異。當(dāng)溶液pH值達(dá)到11時(shí)，溶液的顏色變?yōu)樽霞t色，熒光幾乎猝滅，可見(jiàn)光譜中出現(xiàn)了一個(gè)平而寬的吸收峰。當(dāng)pH值大于11時(shí)，紫膠色酸A熒光強(qiáng)度迅速顯著增加，可見(jiàn)光區(qū)出現(xiàn)雙吸收峰，最大吸收波長(zhǎng)分別為530 nm和565 nm。紫膠色酸A在不同pH值范圍內(nèi)呈現(xiàn)出熒光強(qiáng)度變化的差異性可能與其分子結(jié)構(gòu)中的羧基、羥基（酚）的電離有關(guān)[27-28]，pH值在4～10之間，紫膠色酸A主要以分子形態(tài)存在；pH值在11左右，分子中的兩個(gè)羧基發(fā)生電離；當(dāng)pH值大于11時(shí)，羥基（酚）開(kāi)始電離，紫膠色酸A主要以離子形態(tài)存在。因此，考察其他因素對(duì)紫膠色酸A的熒光影響時(shí)可選擇pH值為4～10之間的溶液。

2.4 紫膠色酸A對(duì)金屬離子的選擇性識(shí)別

如圖5A所示，在75%乙醇溶液體系中加入Na+、K+、Cd2+、Ag+、NH4+、Mn2+和Hg2+等金屬離子對(duì)紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有產(chǎn)生影響，Cu2+、Fe3+、Fe2+和Pb2+四種離子均使紫膠色酸A的熒光幾乎完全猝滅，而Mg2+使其熒光略有增加，Zn2+和Al3+卻使紫膠色酸A熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。究其原因，可能是紫膠色酸A分子中的酚羥基、羧基都是金屬離子的良好配體，易與金屬離子形成配合物從而發(fā)生電子、能量轉(zhuǎn)移等作用[29-30]。同時(shí)，受金屬離子的核外電子排布和電荷的影響，不同的金屬離子對(duì)紫膠色酸A的熒光產(chǎn)生的作用效果出現(xiàn)了差異[29-30]。

圖5 紫膠色酸A在75%乙醇溶液中對(duì)金屬離子的熒光識(shí)別（A）和Al3 ＋、Zn2＋濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響（B）Fig. 5 Fluorescence recognition of metal ions by laccaic acid in 75% ethanol solution (A) and effects of Al3+ and Zn2+ concentration on fluorescence intensity(B)

圖6 熒光光譜（A）和可見(jiàn)光光譜（B）Fig. 6 Fluorescence spectrum (A) and visible spectrum (B)

進(jìn)一步考察Zn2+或Al3+與紫膠色酸A熒光強(qiáng)度的關(guān)系，如圖5B所示，當(dāng)Zn2+的濃度小于4×10－3mol/L時(shí)，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度隨Zn2+的濃度增加而增加，但是繼續(xù)增加Zn2+的濃度，溶液中開(kāi)始產(chǎn)生不溶物，熒光逐漸減弱直至完全猝滅。與加入Zn2+的變化不同，當(dāng)Al3+的濃度小于2.0×10－2mol/L 時(shí)，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度隨Al3+濃度的增加而明顯增加，繼續(xù)增加其濃度，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度幾乎保持不變。由此可見(jiàn)，二者增強(qiáng)紫膠色酸A熒光的機(jī)理可能是不一樣的，這個(gè)推論可由熒光光譜和紫外-可見(jiàn)光光譜得到進(jìn)一步驗(yàn)證。如圖6所示，紫膠色酸A溶液加入Zn2+時(shí)，其發(fā)射波長(zhǎng)和可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)基本沒(méi)變化，然而，加入Al3+時(shí)，紫膠色酸溶液的發(fā)射波長(zhǎng)由590 nm移動(dòng)至625 nm左右，同時(shí)，可見(jiàn)光譜由488 nm向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移至522 nm，同時(shí)出現(xiàn)另一個(gè)吸收峰，其可見(jiàn)光區(qū)的最大吸收波長(zhǎng)為562 nm。據(jù)此，可推測(cè)Zn2+增強(qiáng)紫膠色酸A熒光的原因可能是Zn2+與色酸分子中的N原子和—OH作用下發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移，而Al3+與色酸分子中多個(gè)位點(diǎn)的—OH和—COOH形成不同的配合物，發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移[29-30]。綜合以上，在所考察的金屬離子中，只有Al3+顯現(xiàn)出顯著增強(qiáng)紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度的特異性。

2.5 抗干擾性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7 其他金屬離子對(duì)探針識(shí)別Al3＋的影響Fig. 7 Effect of other metal ions on Al3+ recognition by fluorescence probes

如圖7所示，在含有Al3+的紫膠色酸A的75%乙醇溶液中加入其他金屬離子，F(xiàn)e3+與Al3+共存時(shí)體系的熒光猝滅，Zn2+和Pb2+與Al3+共存時(shí)體系的熒光強(qiáng)度有所降低，而其他金屬離子共存時(shí)并未明顯改變體系的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，在沒(méi)有Fe3+、Zn2+和Pb2+離子的環(huán)境中，紫膠色酸A對(duì)Al3+選擇性識(shí)別的抗干擾性較強(qiáng)、選擇性較好，紫膠色酸A具有開(kāi)發(fā)成為熒光探針用于檢測(cè)Al3+的潛在應(yīng)用。

2.6 紫膠色酸A濃度與其熒光強(qiáng)度的關(guān)系

圖8 紫膠色酸A濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系圖Fig. 8 Relationship between laccaic A concentration and fluorescence intensity

如圖8所示，在紫膠色酸A的75%乙醇溶液中，無(wú)論溶液中是否加入Al3+，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度都隨其濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的變化。然而，在未加Al3+時(shí)，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度很低，若用熒光法檢測(cè)其濃度，誤差較大，而加入Al3+后其熒光強(qiáng)度最大可增強(qiáng)6 倍多，因此，可考察Al3+存在的條件下，紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度與其濃度的關(guān)系。結(jié)果表明，紫膠色酸A在Al3+（0.04 mol/L）存在的條件下，其在1×10－5～8×10－5mol/L濃度范圍內(nèi)與其熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，對(duì)線性進(jìn)行擬合得到方程y=326.2x+467.7，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.995 2。

圖9 紫膠色酸A在自然光（A）和紫外光365 nm波長(zhǎng)處（B）的照片F(xiàn)ig. 9 Pictures of laccaic acid A in natural light (A) and UV light (365 nm, B)

如圖9所示，在Al3+（0.04 mol/L）存在的條件下，紫膠色酸A的75%乙醇溶液在自然光下，溶液顏色由淺變深，紫紅色變?yōu)榧t色再變?yōu)榘导t色；熒光呈現(xiàn)淡紫色至橙色再到紅色直至無(wú)熒光的變化。

2.7 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 紫膠色酸A檢測(cè)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n= 3）Table 1 Application of the fluorescence method for laccaic acid A detection in beverages (n= 3)

如表1所示，以Al3+為標(biāo)準(zhǔn)液，用熒光法檢測(cè)兩種不同飲料中添加的紫膠色酸A含量，樣品回收率在95.0%～109.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%～5.4%之間，結(jié)果表明，在Al3+（0.04 mol/L）存在的條件下，可用熒光法檢測(cè)紫膠色酸A在樣品中的含量，該方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

紫膠色酸A可發(fā)射較強(qiáng)熒光，溶劑的化學(xué)特性和極性、其自身濃度以及溶液的酸堿性都會(huì)影響其熒光強(qiáng)度和發(fā)射波長(zhǎng)。

紫膠色酸A對(duì)不同的金屬離子具有一定的識(shí)別作用，在75%乙醇溶液中，Na+、K+、Cd2+、Ag+、NH4+、Mn2+和Hg2+等金屬離子對(duì)其熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有影響，Cu2+、Fe3+、Fe2+和Pb2+四種離子均可猝滅其熒光，而Zn2+和Al3+顯著增強(qiáng)了紫膠色酸A的熒光強(qiáng)度。

在75%乙醇溶液中，Al3+顯現(xiàn)出顯著增強(qiáng)紫膠色酸A熒光強(qiáng)度的特異性；在Al3+（0.04 mol/L）存在的條件下，紫膠色酸A在其濃度為1.0×10－5～8.0×10－5mol/L的范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以Al3+為標(biāo)準(zhǔn)液，用熒光法檢測(cè)兩種不同飲料中添加紫膠色酸A的含量，樣品回收率在95.0%～109.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%～5.4%之間，該方法具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。