李齊東，高 璐，蔣建雄，武艷芳，李 霞，王永麗，劉瑤瑤，孫建中

(江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，生物質(zhì)能源研究所，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

農(nóng)作物秸稈是自然界中儲量豐富的可再生資源，具有來源廣泛、成本低廉等特點。中國秸稈資源十分豐富，每年農(nóng)作物秸稈的總量約為 6×108～8×108t[1-2]，約占世界秸稈總量的20%[3]。秸稈資源的充分利用，有利于減少秸稈丟棄甚至焚燒帶來的環(huán)境污染，降低化石能源消耗，對中國國民經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[4-6]。木質(zhì)纖維素是農(nóng)作物秸稈的主要成分，由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，以分子化學(xué)鍵的形式緊密連接，形成天然的抗降解屏障[7]，限制秸稈的降解利用。傳統(tǒng)的木質(zhì)纖維素利用成本較高，效率有限，而且極易造成二次環(huán)境污染，阻滯其產(chǎn)業(yè)化的快速發(fā)展。

纖維素降解酶在植物中表達重組，能夠減少木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化過程中酶制品的添加量，提高降解酶的作用效率，降低木質(zhì)纖維素降解的成本，具有重要的應(yīng)用前景和學(xué)術(shù)價值。其中，嗜熱纖維素降解酶的活性溫度遠(yuǎn)高于植物正常生長的溫度[8]，受到相關(guān)科研工作者的廣泛重視。但仍有研究結(jié)果[9-10]表明，由于嗜熱纖維素降解酶在常溫下仍有一定活性，在植物中的表達會干擾植物細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致植物抗逆性降低，組織器官坍塌或植株矮化畸形，造成產(chǎn)量下降甚至植株死亡的后果，制約嗜熱纖維素降解酶在作物和能源植物遺傳改良中的應(yīng)用。

為避免轉(zhuǎn)基因?qū)χ参镎ＩL的影響，不少研究者采用定向胞外或細(xì)胞器積累表達的策略，目的基因產(chǎn)物被限制在特定的器官、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中[11]。亞細(xì)胞定位對促進蛋白質(zhì)表達，明確蛋白質(zhì)功能具有重要作用[12-13]。利用這一策略能明確嗜熱纖維素降解酶定位表達對植物細(xì)胞壁的影響及其對植物秸稈降解的效率，保證植物正常生長，以實現(xiàn)秸稈高效降解利用的目的。

本研究擬在植物不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,對來源于解纖維素?zé)崴峋?Acidothermuscellulolytics)的嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶基因(E1)進行定位表達。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達技術(shù)，利用洋蔥表皮和煙草進行目的基因定位研究，在倒置熒光顯微鏡下觀察基因表達產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，以期為進一步探索嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶(E1)不同的定位表達在秸稈高效轉(zhuǎn)化和資源化利用中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料 本氏煙(Nicotianabenthamiana)由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。洋蔥(AlliumcepaL.)購于本地菜市場。

1.1.2 試驗試劑 限制性內(nèi)切酶(NotI、NcoI、XbaI和SalI)購自NEB有限公司，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針(ER-Traker Red，NO. C1041)購自碧云天生物技術(shù)有限公司，線粒體紅色熒光探針(MitoTraker? Deep Red FM，NO. 40741ES50)購自上海翊圣生物科技有限公司，葉綠體紅色熒光染色菌液由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供

1.2 試驗方法

1.2.1E1基因序列優(yōu)化與合成 利用在線軟件Graphical Codon Usage Analyzer對E1基因的密碼子偏好性進行分析，并根據(jù)禾本科模式植物水稻(Oryzasativa)的密碼子偏好性優(yōu)化E1基因序列，確保每個密碼子的偏好率均高于10%，尤其是N端密碼子的偏好率大于20%。在E1基因的N端和C端分別添加了NcoI和NotI酶切位點。

1.2.2 植物亞細(xì)胞定位表達載體的構(gòu)建 優(yōu)化后的E1基因經(jīng)過NotI和NcoI雙酶切，分別與5個不同亞細(xì)胞定位信號肽的ImpactVectors載體連接，構(gòu)建成E1-IV1.1～E1-IV1.5系列載體，其中載體編號1.1表示不含有信號肽，1.2表示通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的胞外信號肽，1.3表示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽，1.4表示葉綠體信號肽，1.5表示線粒體信號肽。利用PCR技術(shù)將上述載體中信號肽-E1基因序列擴增。根據(jù)載體序列設(shè)計的PCR擴增引物分別為：正向擴增引物(1.1S)5′-GTCCATTCCTCCTAAGTATCTAGAA-3′，反向擴增引物(1.1A)5′-GCACGCGTCGACGCCGCGCTCGCGGCGCACGCAA-3′，反向擴增引物(1.3A) 5′-GCACGCGTCGACGAAGTTCGTCCTTGTGA-3′(其中下劃橫線部分表示酶切位點，斜體部分表示保護堿基)。將純化后的PCR產(chǎn)物分別雙酶切，然后連接到Cam35S-GFP植物表達載體中，構(gòu)建表達含有信號肽和E1-GFP融合蛋白質(zhì)的植物亞細(xì)胞器定位表達載體。

1.2.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化 根癌農(nóng)桿菌(AgrobacteriumtumefaciensEHA105)感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化參照王關(guān)林等[14]的方法進行，轉(zhuǎn)化后在YEB固體選擇培養(yǎng)基(含有50 μg/ml利福平和100 μg/ml卡那霉素)中倒置暗培養(yǎng)48 h，分別挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落，用材料與方法1.2.2中引物1.1A、1.1S和1.3A進行菌落PCR鑒定。

1.2.4 煙草與洋蔥表皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及熒光倒置顯微鏡觀察 本研究選用洋蔥和煙草2種試驗材料進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)和亞細(xì)胞定位分析。用洋蔥表皮細(xì)胞進行細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)外體定位表達分析，采用煙草葉片進行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體和線粒體定位表達分析。

1.2.4.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥瞬時表達系統(tǒng) 取無菌的洋蔥表皮切至大小約1 cm2，于固體1/2 MS培養(yǎng)基中28 ℃暗培養(yǎng)24 h后，用含1/2 MS滲透培養(yǎng)基[10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸，100 μmol/L乙酰丁香酮]重懸后[13]的重組農(nóng)桿菌侵染15 min，共培養(yǎng)48 h(25 ℃，32 h光照，16 h黑暗)。將洋蔥表皮細(xì)胞清洗干凈，并制片用于熒光倒置顯微鏡觀察。用30%蔗糖溶液浸泡侵染過的洋蔥表皮細(xì)胞10 min，使其發(fā)生質(zhì)壁分離，用于質(zhì)外體表達融合蛋白質(zhì)的驗證觀察。

1.2.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達系統(tǒng) 離心重組農(nóng)桿菌，收集，用1 ml 10 mmol/L的MgCl2重新懸浮洗滌菌體后，離心棄去上清液，采用滲透培養(yǎng)基[13][10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸，100 μmol/L乙酰丁香酮]重新懸浮菌體，于25 ℃下避光靜置4 h。選取成熟的煙草葉片，避開葉脈，從下表皮將菌液緩慢均勻地注射入煙草葉片。避光12 h后，培養(yǎng)48 h(溫度25 ℃，光照32 h，黑暗16 h)。亞細(xì)胞定位熒光探針于觀察前注射于煙草葉片下表皮，注射后避光30 min，撕取葉片下表皮細(xì)胞，制片，用熒光倒置顯微鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 E1基因優(yōu)化

目的基因在異源表達前，通常要進行外源目的基因的優(yōu)化處理。優(yōu)化密碼子偏好性分析結(jié)果(表1)顯示，7種氨基酸(114處)的密碼子在植物中的相對適應(yīng)性較低，平均為45%。通過基因優(yōu)化后，共計改變了150個堿基序列。優(yōu)化后密碼子序列的平均相對適應(yīng)性提高到91%，有利于E1基因高效穩(wěn)定表達。

2.2 植物不同亞細(xì)胞定位表達載體的構(gòu)建和驗證

以帶有不同亞細(xì)胞定位信號肽的ImpactVectors系列載體為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建含有信號肽和E1-GFP融合蛋白質(zhì)的植物亞細(xì)胞定位表達載體(圖1)。

表1E1基因優(yōu)化及密碼子的相對適應(yīng)性

Table1E1geneoptimizationandcodonrelativeadaptability

氨基酸 密碼子優(yōu)化前優(yōu)化后相對適應(yīng)性(%)優(yōu)化前優(yōu)化后氨基酸數(shù)量精氨酸CGCCGG20267天冬氨酸GACGAT4710020組氨酸CACCAT641005亮氨酸CTGCTC426516脯氨酸CCGCCT4710031絲氨酸AGCTCT4610018纈氨酸GTCGTT4810017

采用雙酶切技術(shù)對ImpactVectors-E1載體進行驗證，用NotI和NcoI 2種限制性核酸內(nèi)切酶進行雙酶切，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖(圖2A)顯示，E1基因的片段大小為1 576 bp，ImpactVectors系列空載體大小約為4 700 bp，經(jīng)測序,E1基因片段已完全插入到ImpactVectors-E1融合載體中。對雙元植物表達載體E1-IVs-GFP進行PCR擴增驗證(所用引物同材料與方法1.2.2)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2B)表明，E1基因(帶有不同信號肽基因序列)的片段大小約為1 576 bp，與理論預(yù)測結(jié)果完全一致。

2.3 亞細(xì)胞定位分析

E1基因已插入到Cam35S啟動子和綠色熒光蛋白質(zhì)基因(GFP)中，形成融合表達載體。為了確定帶有綠色熒光的目的蛋白質(zhì)是否在細(xì)胞中特定部位實現(xiàn)了表達，將融合表達載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞和煙草葉片中，并用熒光倒置顯微鏡進行觀察。

2.3.1E1基因的細(xì)胞質(zhì)定位表達分析 不帶有信號肽的E1融合蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位表達如圖3顯示，熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不帶有信號肽的E1-IV1.1-GFP表達載體在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中均實現(xiàn)了表達。由于洋蔥表皮細(xì)胞中含有液泡，故GFP綠色熒光蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)近膜區(qū)域表達較為充分。

2.3.2E1基因的質(zhì)外體定位表達分析 帶有分泌表達信號肽的E1融合蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位表達如圖4顯示，熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，帶有分泌表達信號肽的E1-IV1.2-GFP表達載體在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁上實現(xiàn)了表達，與分泌表達信號肽的定位位置完全一致，說明目的蛋白質(zhì)已分泌至膜外區(qū)域。

A：植物表達載體構(gòu)建流程；B：含有不同信號肽的E1基因結(jié)構(gòu)。Not I、Nco I、Xba I和Sal I均表示限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點；CaMV35S：35S啟動子；GFP：綠色熒光蛋白基因；LB：left border 載體導(dǎo)入基因片段的左側(cè)邊界；RB：right border載體導(dǎo)入基因片段的右側(cè)邊界；Kana：抗卡那霉素的基因片段；Amp：抗氨芐青霉素的基因片段；SP：信號肽；SPS：分泌型信號肽；ERR：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽；SPC：葉綠體信號肽；RSSUI：Rubisco小亞基蛋白質(zhì)內(nèi)含子；SPM：線粒體信號肽。圖1 植物表達載體的構(gòu)建Fig.1 The construction of plant expression vectors

A: ImpactVectors-E1質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳；B: E1-IVs-GFP質(zhì)粒PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。圖2 酶切及PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 The enzyme digestion and PCR products agarose gel electrophoresis

A:明場圖；B:綠色熒光圖；C:疊加圖。圖3 不帶有信號肽的E1- GFP融合蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位Fig.3 Localization of E1-GFP fusion protein without signal peptide in onion epidermal cells

A:明場圖；B:綠色熒光圖；C：疊加圖。圖4 帶有分泌表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位Fig.4 Localization of E1-GFP fusion protein with secreted signal peptide in onion epidermal cells

2.3.3E1基因的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位表達分析 帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽的E1融合蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位表達如圖5顯示，將帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白質(zhì)的E1-IV1.3-GFP表達載體導(dǎo)入煙草葉片中，采用ER-Traker Red內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針進行細(xì)胞染色。熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白質(zhì)的分布范圍與紅色熒光完全一致，表明帶有GFP熒光標(biāo)記目的蛋白質(zhì)的主要表達位置是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

A：明場圖；B：綠色熒光圖；C：紅色熒光圖；D：紅色熒光與綠色熒光疊加圖。圖5 帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質(zhì)在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位Fig.5 Localization of E1-GFP fusion protein with endoplasmic reticulum signal peptide in onion epidermal cells

2.3.4E1基因的葉綠體定位表達分析 帶有葉綠體表達信號肽的E1融合蛋白質(zhì)在煙草葉肉細(xì)胞中的定位表達如圖6顯示，將帶有葉綠體定位信號肽序列的E1-IV1.4-GFP表達載體導(dǎo)入煙草葉片中，采用葉綠體紅色熒光探針進行細(xì)胞染色，熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白質(zhì)的分布范圍與紅色熒光完全一致，說明帶有GFP熒光標(biāo)記的目的蛋白質(zhì)在葉綠體上獲得了充分表達。

A：明場圖；B：綠色熒光圖；C：紅色熒光圖；D：紅色熒光與綠色熒光疊加圖。圖6 帶有葉綠體表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質(zhì)在煙草葉肉細(xì)胞中的定位Fig.6 Localization of E1-GFP fusion protein with chloroplast signal peptide in tobacco mesophyll cells

2.3.5E1基因的線粒體定位表達分析 帶有線粒體定位表達信號肽的E1融合蛋白質(zhì)在煙草葉肉細(xì)胞中的定位表達如圖7顯示，將帶有線粒體定位信號肽序列的E1-IV1.5-GFP表達載體導(dǎo)入煙草葉片中，采用MitoTraker線粒體紅色熒光探針進行細(xì)胞染色，熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白質(zhì)的分布范圍與紅色熒光完全一致，表明帶有GFP熒光標(biāo)記的目的蛋白質(zhì)在線粒體上獲得了充分表達。

A：明場圖；B：綠色熒光圖；C：紅色熒光圖；D：紅色熒光與綠色熒光疊加圖。圖7 帶有線粒體表達信號肽的E1-GFP融合蛋白質(zhì)在煙草葉肉細(xì)胞中的定位Fig.7 Localization of E1-GFP fusion protein with mitochondrial signal peptide in tobacco mesophyll cells

3 討 論

植物中木質(zhì)纖維素的難降解性是生物質(zhì)能源商業(yè)可行性的主要限制因素。近幾年，植物基因工程技術(shù)得到了廣泛重視，成為改造能源植物以及促進木質(zhì)纖維素高效降解的重要手段[15]。E1基因是嗜熱纖維素降解酶基因家族中的關(guān)鍵基因[11]，對E1基因亞細(xì)胞的定位表達進行研究具有重要意義。相關(guān)研究結(jié)果[11,16]表明，在實際生產(chǎn)應(yīng)用過程中，E1蛋白質(zhì)重組纖維素酶的最適活性溫度在60 ℃以上，其貯存穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均較好。

本研究成功構(gòu)建了帶有5種不同信號肽編碼序列E1-IVs-GFP系列植物表達載體，并在植物體內(nèi)實現(xiàn)了不同的亞細(xì)胞定位表達。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間隙是植物細(xì)胞生命活動的重要場所[17]。耐高溫纖維素降解酶在玉米細(xì)胞的質(zhì)外體中表達，重組纖維素酶的表達量占可溶性總蛋白質(zhì)的2.1%，并獲得了845 mU/mg總蛋白質(zhì)的酶活性，這是迄今為止得到的較高活性[18]。本研究結(jié)果為嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間隙中的蛋白質(zhì)功能和表達效果研究奠定了基礎(chǔ)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為重要的植物細(xì)胞器，密切參與蛋白質(zhì)的合成過程，是重要的蛋白質(zhì)運輸通道。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號肽(KDEL)可以使蛋白質(zhì)從高爾基體回流到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而使蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[19]。本研究采用KDEL定位信號，取得了較好的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位效果。線粒體與細(xì)胞呼吸、細(xì)胞凋亡[20]等關(guān)系密切，某些蛋白質(zhì)通過破壞細(xì)胞線粒體的功能從而影響植物的正常生長[21]，因此關(guān)于線粒體的研究是嗜熱內(nèi)切葡聚糖酶對植物生長發(fā)育影響研究的重要組成部分。本研究利用酵母菌CoxIV分泌信號在線粒體基質(zhì)中傳遞蛋白質(zhì)[22]，將目的蛋白質(zhì)與酵母CoxIV信號肽的前4個氨基酸融合，以保證目的蛋白質(zhì)的正確定位。葉綠體是植物細(xì)胞進行光合作用的細(xì)胞器，是植物進行糖類合成的重要場所，在植物的生長發(fā)育過程中起著不可替代的作用。導(dǎo)入葉綠體的外源基因必須在適當(dāng)調(diào)控蛋白質(zhì)[23]的控制下才能在葉綠體中表達，本研究利用菊花小亞基蛋白質(zhì)的分泌信號將蛋白質(zhì)輸送到葉綠體基質(zhì)中，與Rubisco蛋白質(zhì)的前11個氨基酸融合，確保信號肽的正確加工。

本研究結(jié)果表明，E1-GFP融合蛋白質(zhì)集中分布在信號肽所對應(yīng)的細(xì)胞器內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中表達熒光強度較高，具有較好的表達效果。以上研究結(jié)果為E1基因在植物中的不同亞細(xì)胞定位表達及植物木質(zhì)纖維素的高效降解利用提供了理論依據(jù)和研究基礎(chǔ)。