潘德全 王 瑋 付文錕 蔡琳俐 葉江輝 朱 樺 程 通 夏寧邵

(國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，廈門大學生命科學學院，廈門 361102)

水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)是導致水痘(Chicken pox)和帶狀皰疹(Shingles)的病原體。VZV初次感染可引發(fā)水痘，水痘是一種急性、高傳染性疾病，多發(fā)于嬰幼兒階段；感染后病毒會長期潛伏在患者的脊髓背根神經(jīng)節(jié)或顱神經(jīng)的感覺神經(jīng)節(jié)中，在外傷、人體衰老以及免疫低下等狀況下可能會再次激活引發(fā)帶狀皰疹，恢復后常伴有愈后神經(jīng)痛并且會引發(fā)其他較嚴重的神經(jīng)并發(fā)癥[1-4]。接種疫苗是目前預防VZV流行的最有效手段，VZV Oka株是目前主要使用的水痘減毒活疫苗株，雖然能夠有效預防水痘，但由于其為混合株，仍存在一定安全隱患[5,6]。因此，開發(fā)更為安全高效的新型水痘-帶狀皰疹疫苗是十分必要的。病毒感染性滴度的快速檢測對于疫苗效價及相關中和抗體的高效評價是十分重要的。

目前，用于檢測包括VZV在內(nèi)的病毒感染性滴度的經(jīng)典方法主要為空斑計數(shù)法[7]。該方法是基于病毒感染細胞后導致細胞裂解形成空斑，繼而通過觀察統(tǒng)計病變斑點的數(shù)量來分析病毒滴度。空斑計數(shù)法對于多數(shù)病毒樣品具有較好的適用性，然而該方法存在檢測周期長、操作繁瑣等缺點，難于滿足快速高效檢測病毒效價的需求[8]。當前隨著新型檢測技術的發(fā)展，以高特異性和親和力的標記抗體為生物探針，可實現(xiàn)對病毒感染細胞的特異標記，從而可快速進行病毒感染性滴度的檢測。在目標檢測抗原的選擇上，病毒編碼的立即早期蛋白具有表達時間早、利于快速檢測的特點，可成為較為理想的檢測靶標。目前，已有多種病毒包括桿狀病毒[9]、單純皰疹Ⅰ型病毒[10]、巨細胞病毒[11]、EB病毒[12]等以病毒編碼的立即早期蛋白為靶標建立了新型感染性滴度檢測方法。

VZV完整基因組至少含有70個開放讀碼框(ORF)，目前已知編碼了3種立即早期蛋白，包括IE4(由ORF 4編碼)、IE62(由ORF 62和ORF 71編碼)和IE63(由ORF 63和ORF 70編碼)[13]。其中，IE62是目前研究中已知的功能相對較為明確的病毒蛋白，是病毒主要的轉(zhuǎn)錄激活因子，是病毒復制的必需蛋白，具有重要的功能[14-17]。同時研究也顯示，IE62具有表達豐度較高的特點[18]。因此，本研究探索以VZV立即早期蛋白IE62作為檢測抗原，制備特異性單克隆抗體，應用酶聯(lián)免疫斑點技術(ELISpot)結(jié)合生物素-親和素放大方法[19,20]，建立新型的VZV感染性滴度檢測方法。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑

1.1.1主要試劑 牛血清白蛋白(BSA)、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、次黃嘌呤﹑胸腺嘧啶、氨基喋呤、TRITC標記山羊抗小鼠IgG、DMSO以及酶標試劑、小鼠抗體分型ELISA試劑盒等購自Sigma公司；PCR buffer、dNTP、Phusion DNA聚合酶、DL2000 DNA Maker、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和SmaⅠ購自TaKaRa公司；DNA片段回收和質(zhì)粒小提試劑盒購自TianGen公司；Gibson Assembly Master Mix購自NEB公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑、RPMI1640和DMEM/F12 培養(yǎng)基、Gibco 胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG 購自CST 公司。

1.1.2菌種與質(zhì)粒 真核表達載體pLV-Puro、大腸桿菌ER2566均由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α(CB101)感受態(tài)購自TianGen公司。

1.1.3細胞株、病毒株和實驗動物 小鼠骨髓瘤細胞SP2/0、人胚胎腎細胞293T、人視網(wǎng)膜色素上皮細胞ARPE-19均為本實驗室保存；VZV pOka病毒株、VZV-rOka(EGFP)病毒株由美國Rutgers大學Hua Zhu教授實驗室提供。6～8周齡SPF級BALB/c雌鼠購自上海斯萊克實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1多肽合成與偶聯(lián) 應用DNAstar Protean軟件對IE62基因進行分析，選取IE62 N端具有較好親水性的多肽序列IE62-N1-15：MDTPPMQR-STPQRAG,多肽由上海生工生物公司進行合成。獲得合成后的多肽干粉，將2 mg 干粉溶于500 μl MES BUFFER，2 mg BSA 溶于200 μl MES BUFFER，以及10 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)溶于1 ml ddH2O，再將500 μl的多肽溶液與200 μl的BSA溶液混合均勻，然后加入100 μl EDC，使用垂直混勻儀室溫混勻2 h，然后透析至PBS，收取樣品，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2單克隆抗體的制備 選擇4只6～8周齡的BALB/c 雌鼠，以偶聯(lián)的多肽抗原乳化完全弗氏佐劑進行皮下免疫，免疫劑量為100 μg/只，之后每兩周使用同樣的抗原乳化不完全弗氏佐劑進行加強免疫，持續(xù)免疫3針，每次免疫前采集小鼠血清。最后使用相同的抗原進行脾臟免疫，3 d后取免疫小鼠的脾臟與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合獲得雜交瘤細胞，相關的細胞融合實驗按照常規(guī)方法進行[21]。

1.2.3單抗篩選純化和抗體類型及亞類鑒定 采用間接ELISA法對雜交瘤細胞進行篩選。將合成的多肽包被于聚氯乙烯板上，封閉后加入待檢樣品進行孵育，之后加入HRP 標記的羊抗鼠二抗，最后用1∶1 混合的顯色液A、B液進行顯色，終止后用酶標儀測定各孔單波長450 nm的OD值，將檢測陽性的克隆采用有限稀釋法進行至少2次以上的克隆化，直到篩選獲得穩(wěn)定的克隆株。將獲得的穩(wěn)定克隆株細胞進行擴增培養(yǎng)后收集注入小鼠腹腔，待小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，用飽和硫酸銨沉淀和Protein A親和層析純化單克隆抗體，并采用Sigma公司的小鼠單克隆抗體分型試劑盒，按照試劑盒使用說明書鑒定單克隆抗體的類型及亞類。

1.2.4VZV IE62真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 通過Oligo 5.0 軟件設計IE62全長基因擴增引物，上游引物IE62-PLV-F：5′-TCTAGAGAATTCGGATCCATGGATACGCCGCCGATG-3′，下游引物IE62-PLV-R：5′-CCATGGCTCGAGCCCGGGTCACCCCCGACTC-TGCGG-3′，該引物由上海生工生物公司合成；以VZV pOka 基因組為模板對IE62基因全長進行PCR擴增和片段回收，再通過Gibson Assembly 系統(tǒng)將獲得的片段與經(jīng)由BamHⅠ/SmaⅠ雙酶切后的pLV-Puro載體進行連接，構(gòu)建VZV-IE62的真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，通過PCR鑒定篩選陽性克隆后交由上海生工生物公司進行測序。

1.2.5單克隆抗體的特異性鑒定 根據(jù)常規(guī)分子生物學實驗方法：(1)間接免疫熒光實驗：將直徑為13 mm圓形玻璃片放入24孔板中，鋪入1×105個/孔的ARPE-19細胞，實驗組按MOI=0.1接種VZV-pOka；37℃感染48 h后，用4%多聚甲醛固定30 min并依次加入通透液、抗VZV-IE62的單克隆抗體、GAM-TRITC IgG和DAPI染液，封片后在熒光顯微鏡下進行結(jié)果觀察。(2)免疫印跡實驗：將轉(zhuǎn)染pLV-IE62或pLV-puro真核表達質(zhì)粒的293T細胞以及VZV-pOka感染或未感染的ARPE-19細胞經(jīng)裂解液裂解后進行SDS-PAGE，隨后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，1∶500稀釋抗VZV-IE62單克隆抗體作為一抗，過氧辣根酶標記的GAM-IgG作為二抗，顯色后進行結(jié)果觀察。

1.2.6抗體生物素標記 根據(jù)Sigma 公司酶標試劑使用說明書，將抗VZV-IE62單克隆抗體用0.1 mol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH8.0)稀釋到1 mg/ml，加入120 μl濃度為1 mg/ml的N-羥基琥珀酰亞胺生物素溶液(DMSO溶解)，室溫混勻2 h；加入9.6 μl濃度為1 mol/L的NH4Cl，在室溫下攪拌10 min，經(jīng)過PBS透析除去游離的生物素；通過分子篩洗脫獲得標記生物素的抗體，最后，樣品加入疊氮鈉(終濃度0.5 g/L)及1 g/L BSA。最終產(chǎn)物加入50%重蒸甘油，置于-20℃保存。

1.2.7空斑計數(shù)法測定VZV的感染性滴度[7]待感染VZV后的ARPE-19細胞90%病變后，用細胞刮收集病變細胞，加入適量病毒保護液儲存于-80℃，后續(xù)實驗中取出病毒常溫溶解后200 g離心15 min，取上清作為VZV無細胞(cell-free)病毒懸液使用。實驗之前4 h先將ARPE-19細胞以1×105個/孔的密度均勻鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中，加入梯度稀釋后的VZV無細胞病毒，37℃孵育1 h；換液，在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5～7 d后，利用中性紅進行活細胞染色，于顯微鏡下觀察，統(tǒng)計空斑數(shù)量，計算獲得病毒樣品的感染性滴度(PFU/ml)=(每孔平均空斑個數(shù)× 病毒稀釋倍數(shù))/每孔病毒接種量(ml)。

1.2.8基于IE62建立VZV感染性滴度檢測方法 實驗之前4 h先將ARPE-19細胞以1×105個/孔的密度均勻鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中，加入4倍梯度稀釋后的VZV無細胞病毒樣品100 μl，37℃孵育1 h，換液；在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32 h后，進行ELISpot實驗：每孔加入100 μl 1%甲醛+0.1%戊二醛固定液，室溫避光固定10 min；然后，每孔用0.3%Triton X-100室溫通透細胞10 min；加入生物素標記的抗VZV-IE62單克隆抗體稀釋液，37℃孵育90 min；PBST漂洗5次后加入親和素與標記HRP的生物素混合液，37℃孵育45 min；漂洗5次，加入TMB顯色液(Sigma)，室溫顯色10 min；扣干顯色液，統(tǒng)計各孔的藍色斑點數(shù)量，計算線性相關區(qū)內(nèi)域斑點數(shù)量與病毒稀釋度的標準曲線y=ax+b，計算獲得病毒樣品的感染性滴度(U/ml)=[(aN50+b)× 病毒稀釋倍數(shù)]/每孔病毒接種量(ml)，其中N50 為線性區(qū)域的中位值。

1.3統(tǒng)計學處理 計數(shù)資料以SEM表示,采用GraphPad Prism5.01 軟件中單因素方差分析統(tǒng)計各組間的差異,P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1抗VZV-IE62單克隆抗體的制備純化與鑒定 本研究將人工合成多肽IE62-N1-15與BSA進行偶聯(lián)后作為抗原免疫BALB/c小鼠，隨后通過雜交瘤技術和間接ELISA法，經(jīng)過3次有限稀釋法克隆化篩選獲得13株可分泌針對VZV-IE62蛋白N端的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并制備純化獲得相應的單克隆抗體。經(jīng)ELISA檢測評價，結(jié)果如圖1所示，其中單抗1B7具有較優(yōu)的免疫反應性和特異性。使用Sigma公司的小鼠單克隆抗體分型ELISA試劑盒鑒定單抗1B7屬于IgG2a亞型。應用單抗1B7對分別轉(zhuǎn)染pLV-Puro空載與VZV-IE62真核表達質(zhì)粒pLV-IE62的293T細胞裂解液，以及與未感染或感染VZV的ARPE-19細胞裂解液進行Western blot檢測。結(jié)果如圖2A所示，1B7可與轉(zhuǎn)染pLV-IE62質(zhì)粒的293T細胞裂解液以及VZV感染的ARPE-19細胞裂解液特異性反應，檢出的主要蛋白條帶位置約170 kD，與VZV-IE62的分子量相當，同時與作為陰性對照的293T細胞裂解液、轉(zhuǎn)染pLV-Puro空載的293T細胞裂解液和ARPE-19細胞裂解液均不反應。本研究進一步應用免疫熒光法進行1B7的反應性分析，應用1B7分別對轉(zhuǎn)染VZV-IE62表達質(zhì)粒pLV-IE62或?qū)φ蛰d體pLV-Puro的293T細胞，以及感染VZV后的和未感染的ARPE-19細胞進行免疫熒光檢測，檢測結(jié)果如圖2B、C所示，1B7能夠特異性與轉(zhuǎn)染了IE62表達載體或VZV感染后的細胞反應，具有良好的反應特異性。上述研究結(jié)果說明，單抗1B7可用于特異檢測VZV感染后的細胞，因此本研究選擇單抗1B7用于后續(xù)研究。

圖1 使用ELISA方法對VZV-IE62單克隆抗體的評價Fig.1 Evaluation of anti-VZV-IE62 mAbs by ELISA

圖2 抗VZV-IE62單抗1B7性質(zhì)鑒定Fig.2 Identification of anti-VZV-IE62 mAb 1B7Note: A.Western blot of cell extracts of 293T cells transfected or not with pLV-Puro or pLV-IE62 and ARPE-19 cells uninfected or infected with VZV using mAb 1B7.1.Untreated 293T cells;2.293T cells transfected with pLV-Puro;3.293T cells transfected with pLV-IE62;4.Uninfected ARPE-19 cells;5.VZV-infected ARPE-19 cells；B.Immunofluorescence analysis of 293T cells transfected with pLV-Puro or pLV-IE62 using mAb 1B7;C.Immunofluorescence analysis of ARPE-19 cells mock-infected or infected with VZV using mAb 1B7.

2.2基于VZV-IE62單克隆抗體和酶聯(lián)免疫斑點技術建立VZV感染細胞檢測方法 本研究基于獲得的VZV-IE62單克隆抗體1B7，嘗試應用生物素-親和素標記放大方法與酶聯(lián)免疫斑點技術，建立VZV感染細胞的快速特異檢測方法。

首先，本研究分析了生物素標記的單抗1B7用于酶聯(lián)免疫斑點法特異檢測VZV感染細胞的可行性。結(jié)果如圖3A所示，在處理ARPE-19細胞48 h后，感染VZV活病毒的樣品孔中呈現(xiàn)出大量的藍色斑點，而感染滅活病毒和未感染病毒的樣品孔中只有極少量的非特異性斑點，本底較低，這表明生物素標記后的1B7單抗能夠特異性識別被VZV感染的細胞，能夠用于VZV感染細胞的酶聯(lián)免疫斑點法檢測，每個顯色斑點計為一個感染單元(U)。

隨后，本研究繼續(xù)分析了不同的感染時間對檢測效果的影響。在預鋪有ARPE-19細胞的6孔細胞培養(yǎng)板中各加入400 PFU的VZV活病毒，在感染后不同時間點分別用生物素標記的單抗1B7進行酶聯(lián)免疫斑點檢測，同時平行使用相同劑量的滅活病毒樣品以及未感染細胞裂解液作為陰性對照。結(jié)果如圖3B所示，活病毒組檢測獲得的斑點數(shù)量在感染后20 h至32 h呈現(xiàn)上升趨勢，感染32 h后斑點數(shù)量趨于穩(wěn)定，而斑點個體面積會持續(xù)增加；滅活病毒組在樣品加入細胞后的28 h前可檢出斑點，但斑點數(shù)隨加入時間增加而減少，至28 h后為陰性。該現(xiàn)象的原因可能為所使用的VZV感染后細胞裂解液樣品中含有游離的IE62抗原所導致的背景反應，隨著時間延長游離抗原降解，背景反應逐步降低至陰性水平。因此，本研究選擇感染后32 h作為檢測時間點，建立了基于生物素標記的VZV-IE62單克隆抗體1B7與酶聯(lián)免疫斑點技術VZV感染細胞檢測方法(VZV-IE62 ELISpot)用于后續(xù)的VZV感染性滴度檢測研究。

圖3 基于抗VZV-IE62單克隆抗體1B7建立VZV的ELISpot檢測方法Fig.3 Development of a VZV-ELISpot assay using anti-VZV-IE62 mAb 1B7Note: A.Representative images of VZV-IE62 ELISpot assay for live-VZV-infected (left),inactivated-VZV-infected (middle) and uninfected (right) ARPE-19 cells;B.The numbers of spots counted at indicated time points post-infection.

表1VZV-IE62ELISpot方法檢測VZV病毒感染性滴度

Tab.1TitrationofinfectiousVZVusingestablishedVZV-IE62ELISpotmethod

Sample No.DFLinear range (log2N)Standard curve equationR2N50Titer (U/ml)11∶12.7004-10.2027y=149.42x + 12.6840.9962791.78 10521∶23.0875-10.8646y=74.504x + 28.6640.99541489.24 10431∶42.7004-10.0881y=32.012x + 20.4910.9920714.50 10441∶83.2479-11.0035y=21.159x-1.54950.99861252.09 10451∶162.7004-10.0741y=10.768x + 0.81150.99762731.08 10461∶322.1699-9.2796y=6.0480x + 9.88820.99431906.38 103

Note：DF.Dilution factor;N.Number of spots.

圖4 VZV-IE62 ELISpot方法檢測斑點數(shù)與病毒樣品稀釋度的關系Fig.4 Relation between number of detected spots and dilution factor of viral samples

2.3將VZV-IE62 ELISpot方法用于檢測VZV感染性滴度 取一份預先應用經(jīng)典空斑計數(shù)法檢測滴度為1.6×105PFU/ml的VZV病毒樣品，將該樣品進行二倍比系列梯度稀釋獲得樣品1～6(Sample 1-6)，參照試驗方法1.2.8，將每個樣品再進行4倍系列梯度稀釋之后使用VZV-IE62 ELISpot方法進行檢測。結(jié)果如圖4所示，VZV-IE62 ELISpot方法檢測斑點數(shù)量與樣品稀釋倍數(shù)呈現(xiàn)負相關趨勢，并且在一定范圍內(nèi)表現(xiàn)為線性相關，因此認為該方法顯色的斑點數(shù)與VZV病毒的感染劑量在一定范圍內(nèi)呈線性相關，能夠用顯色的斑點數(shù)計算病毒樣品的感染性滴度值(U/ml)。本研究通過分別計算各樣品線性區(qū)域?qū)唿c數(shù)與換算后加入的病毒原液體積的標準曲線，取線性區(qū)域的中位值N50，用于計算所檢測樣品的病毒的感染性滴度(U/ml)，具體如表1所示。

圖5 VZV-IE62 ELISpot與空斑計數(shù)法的一致性分析Fig.5 Correlation between VZV-IE62 ELISpot assay and plaque assay

2.4VZV-IE62 ELISpot方法與空斑計數(shù)的檢測結(jié)果一致性分析 為了驗證本研究建立的VZV-IE62 ELISpot方法用于檢測VZV感染性滴度的有效性，本研究進一步將表1獲得的滴度結(jié)果與經(jīng)典空斑計數(shù)法獲得的滴度結(jié)果進行對比。結(jié)果如圖5所示，兩種方法獲得的檢測結(jié)果在5.00×103～1.78×105PFU/ml的范圍內(nèi)具有較高的相關性，R2達到0.990 3。上述結(jié)果說明，本研究建立的基于抗VZV-IE62單抗1B7與酶聯(lián)免疫斑點技術的VZV感染性滴度檢測方法與經(jīng)典空斑計數(shù)法獲得的檢測結(jié)果具有良好的一致性，可用于VZV的感染性滴度檢測。

3 討論

水痘在全世界范圍內(nèi)均有流行，傳染性極強，人群普遍易感，在1～9歲的兒童中發(fā)病率最高[22]；帶狀皰疹的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，嚴重影響人類的健康狀況[23]。目前，水痘與帶狀皰疹的分子致病機制還有待進一步深入闡釋，二者目前也尚缺乏特效的治療性藥物，新一代的更為安全高效的預防疫苗也亟需發(fā)展。因此，開展VZV的相關基礎與應用研究在公共衛(wèi)生方面具有較為重大的意義。建立更為快速高效的VZV感染性滴度的檢測方法對于支持開展相關研究是十分重要的。本研究基于VZV立即早期蛋白IE62與酶聯(lián)免疫斑點檢測技術，建立了一種新型的VZV感染性滴度檢測方法。

首先，本研究制備了VZV-IE62的單克隆抗體。鑒于IE62的分子量較大，本研究采用合成多肽的形式，在保留部分免疫原性的同時能夠降低抗原制備難度，縮短抗體制備時間，研究中成功獲得13株抗VZV-IE62的單克隆抗體，通過ELISA評價篩選出其中具有較優(yōu)免疫反應性和特異性的抗體1B7。之后，Western blot的檢測結(jié)果顯示1B7所特異性結(jié)合的蛋白與IE62的理論大小相符合；在免疫熒光的檢測結(jié)果中，轉(zhuǎn)染VZV-IE62表達質(zhì)粒的293T細胞中的IE62只分布于細胞核，而在感染VZV的ARPE-19細胞中的IE62在細胞核和細胞質(zhì)都有分布，這與文獻報道的IE62的亞細胞定位相符合[24]。因此，確定1B7抗體可用于后續(xù)實驗中VZV-IE62的特異性檢測。

隨后，本研究將1B7抗體用于酶聯(lián)免疫斑點檢測方法(VZV-IE62 ELISpot)，再結(jié)合生物素-親和素放大系統(tǒng)，成功地將VZV感染細胞的檢測周期縮短至32 h，實現(xiàn)了VZV感染細胞的快速檢測。最后，本研究將所建立的VZV-IE62 ELISpot方法應用于VZV感染性滴度檢測。通過檢測梯度稀釋后的VZV樣品，統(tǒng)計各個稀釋后樣品的顯色斑點數(shù)量，取斑點數(shù)量與稀釋度線性相關的區(qū)域的中位值，計算獲得原始病毒樣品的感染性滴度(U/ml)，并且將該檢測方法所獲得的結(jié)果與空斑法獲得的結(jié)果(PFU/ml)進行一致性分析，確定了兩種方法在檢測區(qū)間內(nèi)具有較高的相關性。因此，本研究所建立的VZV-IE62 ELISpot方法可用于VZV的感染性滴度檢測。

綜上所述，本研究建立了一種新型快速的VZV感染性滴度檢測方法，可進一步為VZV的新型疫苗、抗病毒藥物和致病機制等研究提供有效支持。