鐘開義 黎寶仁 張祖文 藍(lán) 燕 蘇佩瓊 陳雪麗 蘇顯都

(海南西部中心醫(yī)院腎內(nèi)科，那大 571799)

急性腎損傷(Acute renal injury，AKI)是一種由多種病因?qū)е碌?、涉及多學(xué)科領(lǐng)域的臨床綜合征，其在危重癥患者中的發(fā)病率及病死率均較高，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1,2]。微小核糖核酸(microRNA，miR)是一類小的非編碼RNA分子，廣泛參與細(xì)胞增生、凋亡、免疫炎性反應(yīng)等多種機(jī)體生物學(xué)過程的調(diào)控[3]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21及miR-155表達(dá)水平變化影響著腎細(xì)胞的增殖與凋亡，且與AKI的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4,5]。然而，關(guān)于血清miR-21及miR-155在AKI的早期診斷及預(yù)后評估的研究較少。本研究通過分析AKI患者血清miR-21及miR-155表達(dá)水平變化，并比較各指標(biāo)對AKI患者的診斷及預(yù)后評估價值，旨在為尋找AKI新型診斷標(biāo)志物及靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2017年9月海南西部中心醫(yī)院住院確診的AKI患者118例作為研究對象，其中男75例，女43例，年齡21～78歲，平均(46.53±13.26)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①住院時間<24 h，年齡<18歲；②既往有慢性腎臟病史，曾服用過腎損害藥物，有尿路感染，接受過腎臟手術(shù)者；③惡性腫瘤，自身免疫性疾病者。另選擇同期50例體檢正常者作為對照組，其中男30例，女20例，年齡22～74歲，平均(44.85±10.43)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并簽署患者知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1分組方法 AKI患者根據(jù)28 d的生存情況，將其分為存活組和死亡組。其中存活組76例，男47例，女29例，年齡(45.38±12.74)歲；死亡組42例，男28例，女14例，年齡(48.26±13.51)歲。記錄所有患者入院時的體質(zhì)指數(shù)(Body mass index,BMI)、平均動脈壓、心率、體溫、基礎(chǔ)疾病、合并癥、急性生理學(xué)與慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(Acute physiology and chronic health scoring systemⅡ,APACHEⅡ)等基本資料。

1.2.2AKI診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2012《KDIGO急性腎損傷臨床實踐指南》[6]制定的AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)：腎功能在48 h內(nèi)突然減退，表現(xiàn)為血肌酐(sCr)絕對值升高≥26.5 μmol/L；或sCr較基礎(chǔ)值升高≥50%；或尿量減少，尿量<0.5 ml/(kg·h)，并持續(xù)>6 h。AKI分期：①AKI 1期：sCr升高達(dá)基線值的1.5～1.9倍，或升高值≥26.5 μmol/L，和(或)尿量<0.5 ml/(kg·h)，持續(xù)6～12 h。②AKI 2期：sCr升高達(dá)基線值的2～2.9倍；和(或)<0.5 ml/(kg·h)，持續(xù)≥12 h。③AKI 3期：sCr超過基線值3倍，或升高≥353.6 μmol/L或需要啟動腎臟替代治療，和(或)尿量<0.3 ml/(kg·h)，持續(xù)≥24 h，或無尿≥12 h。sCr檢測試劑由寧波美康生物科技股份有限公司提供(苦味酸法)。

1.2.3qRT-PCR檢測 抽取所有研究對象的空腹靜脈血3 ml于無抗凝劑管中，輕輕顛倒數(shù)次后靜置10 min，于室溫2 500 r/min離心15 min，分2層，吸取上層血清400 μl轉(zhuǎn)移至1個EP管中，-70℃保存。在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進(jìn)行實時定量PCR法(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)。參考血清microRNA快速提取試劑盒(北京諾博萊德科技有限公司)的使用說明書提取血清總microRNA。以U6為實驗內(nèi)參,microRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。于ABI 7500型熒光定量PCR儀中行擴(kuò)增和熒光信號檢測，擴(kuò)增條件為：95℃ 10 min 1個循環(huán)，95℃ 15 s、60℃ 60 s進(jìn)行45個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。每個反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定的閾值經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-21及miR-155的相對表達(dá)水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

2 結(jié)果

2.1死亡組和存活組臨床一般資料比較 死亡組的sCr、APACHEⅡ評分明顯高于存活組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而兩組的性別、年齡、BMI、體溫、心率、基礎(chǔ)疾病、合并癥及平均動脈壓比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1死亡組和存活組臨床一般資料比較

Tab.1Comparisonofgeneralclinicaldatabetweendeathgroupandsurvivalgroup

ItemSurvival group(n=76)Death group(n=42)χ2/tPSex(male/female)47/2928/140.2720.602Age(year,x±s)45.38±12.7448.26±13.511.1860.190BMI(kg/m2,x±s)24.38±2.7524.92±3.160.5140.608Heart rate(time/mim,x±s)83.62±9.2784.75±8.520.5060.617Temperature(℃,x±s)37.40±0.8537.86±1.040.6480.529History of diabetes[n(%)]13(17.1)8(19.0)0.0700.792History of hypertension[n(%)]17(22.4)12(28.6)0.5620.454Complication[n(%)]0.4260.408Sepsis32(42.1)19(45.2)Seriously infect21(27.6)10(23.8)Operation15(19.7)9(21.4)Other8(10.5)4(9.5)Mean arterial pressure(mmHg,x±s)85.42±9.5083.28±9.160.6910.497sCr(μmol/L,x±s)215.62±138.43287.40±165.725.1030.006APACHEⅡ score(score,x±s)16.52±6.2822.36±7.358.204<0.001

GroupsnmiR-21miR-155Control group501.06±0.210.36±0.05AKI group1182.92±0.741)1.95±0.421)AKI 1 phase532.48±0.521)1.60±0.251)AKI 2 phase372.81±0.661)1.87±0.361)AKI 3 phase283.85±1.301)2)3)2.73±0.851)2)3)

Note：Vs control group,1)P<0.01；vs AKI 1 phase,2)P<0.01；vs AKI 3 phase,3)P<0.01.

2.2各組血清miR-21及miR-155表達(dá)水平比較 AKI組血清miR-21及miR-155表達(dá)水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AKI 3期血清miR-21及miR-155表達(dá)水平明顯高于AKI 1期和AKI 2期，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AKI 2期血清miR-21及miR-155表達(dá)水平與AKI 1期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3死亡組和存活組血清miR-21及miR-155表達(dá)水平比較 死亡組血清miR-21及miR-155表達(dá)水平明顯高于存活組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4血清miR-21、miR-155及二者聯(lián)合對AKI的診斷價值 血清miR-21及miR-155二者聯(lián)合診斷AKI的AUC(95%CI)為[0.932(0.874～0.993)]明顯優(yōu)于miR-21[0.852(0.791～0.914)]和miR-155[0.826(0.764～0.890)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.902、7.428，P<0.05)；血清miR-21診斷AKI的AUC(95%CI)與miR-155比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.108，P>0.05)。血清miR-21及miR-155診斷AKI的最佳界值分別為2.15、1.28，二者聯(lián)合診斷AKI的敏感度較好，為96.2%。見圖1和表4。

GroupsnmiR-21miR-155Survival group762.60±0.571.68±0.31Death group423.71±1.242.54±0.72t8.7356.419P<0.001<0.001

2.5血清miR-21、miR-155及二者聯(lián)合對AKI患者預(yù)后的評估價值 血清miR-21及miR-155二者聯(lián)合預(yù)測AKI死亡的AUC(95%CI)為[0.904(0.843～0.962)]明顯優(yōu)于miR-21[0.836(0.778～0.898)]和miR-155[0.807(0.749～0.868)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=4.673、7.105，P<0.05)；血清miR-21預(yù)測AKI死亡的AUC(95%CI)與miR-155比較，差異統(tǒng)計學(xué)意義(Z=0.964，P>0.05)。血清miR-21及miR-155預(yù)測AKI死亡的最佳界值分別為3.35、2.16，二者聯(lián)合預(yù)測AKI死亡的敏感度較好，為91.4%。見圖2和表5。

表4血清miR-21、miR-155及二者聯(lián)合對AKI的診斷價值

Tab.4DiagnosticvalueofserummiR-21,miR-155andtwoincombinationwithAKI

ItemOptimal cut-off valueStandarderrorAUC(95%CI)Sensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)positivelikelihoodratioNegativelikelihoodratioPmiR-212.150.0380.852(0.791-0.914)86.079.382.682.74.1550.177<0.001miR-1551.280.0450.826(0.764-0.890)83.577.080.479.63.6300.214<0.001Two combination -0.0160.932(0.874-0.993)96.278.381.693.54.4330.049<0.001

表5血清miR-21、miR-155及二者聯(lián)合對AKI患者預(yù)后的評估價值

Tab.5ValueofserummiR-21,miR-155andtwocombinedtoevaluateprognosisofAKIpatients

ItemOptimal cut-off valueStandarderrorAUC(95%CI)Sensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)positivelikelihoodratioNegativelikelihoodratioPmiR-213.350.0410.836(0.778-0.898)86.478.282.581.93.9630.174<0.001miR-1552.160.0480.807(0.749-0.868)82.074.677.378.63.2280.241<0.001Two combination-0.0250.904(0.843-0.962)91.475.878.688.53.7770.113<0.001

圖1 血清miR-21及miR-155診斷AKI的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum miR-21 and miR-155 in diagnosis of AKI

圖2 血清miR-21、miR-155及二者聯(lián)合評估AKI患者預(yù)后的ROC曲線Fig.2 Serum miR-21,miR-155,and two combined ROC curves for evaluating prognosis of AKI patients

3 討論

AKI是一種由不同病因所致的，以短時間內(nèi)腎小球濾過率迅速下降為主要特點的臨床綜合征，對AKI的早期診斷和預(yù)后判斷是目前腎臟病學(xué)研究的熱點問題。microRNA是一種內(nèi)源性的非編碼微小RNA，其廣泛存在于真核生物中，長度約為22個核苷酸，通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與各種重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化和凋亡，病毒防御、腫瘤轉(zhuǎn)移、血管形成及免疫應(yīng)答等[7，8]。已有研究證實，microRNA在疾病期間及其疾病的不同階段會出現(xiàn)表達(dá)量的變化，并且具有器官組織的表達(dá)特異性，因此microRNA具備作為疾病診斷標(biāo)志物的特點[9]。最近的研究表明，miR-150的缺失可抑制心肌梗死誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷，同時緩解局部炎癥和間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，這種作用可能是通過激活胰島素樣生長因子1受體完成的[10]。Lorenzen等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠缺血再灌注損傷模型和腎移植患者的腎臟內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中存在miR-24的高表達(dá)，在這兩種細(xì)胞中過表達(dá)miR-24能夠加重缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，miR-24通過調(diào)節(jié)組蛋白H2A家族成員X促進(jìn)缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展。另有研究顯示，AKI患者miR-210表達(dá)水平較健康對照組明顯上調(diào)，Cox回歸及Kaplan-Meier曲線分析提示miR-210可以作為獨立預(yù)測AKI患者28 生存率的生物標(biāo)志物，在組織缺血中表達(dá)上調(diào)的microRNA，在AKI患者血清中也呈高表達(dá)，在隨訪中發(fā)現(xiàn)AKI患者的生存期及預(yù)后與外周血microRNA的表達(dá)有關(guān)[12]。本研究顯示，AKI組血清miR-21及miR-155表達(dá)水平明顯高于對照組，AKI 3期血清miR-21及miR-155表達(dá)水平明顯高于AKI 1期和AKI 2期，死亡組血清miR-21及miR-155表達(dá)水平明顯高于存活組。提示血清miR-21及miR-155表達(dá)水平與AKI患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，可能參與AKI的發(fā)生發(fā)展。Saikumar等[13]研究表明在缺血再灌注模型中miR-21及miR-155在腎臟皮髓質(zhì)中均出現(xiàn)明顯變化，其中皮質(zhì)中miR-155在24 h出現(xiàn)表達(dá)高峰，之后開始下降；而髓質(zhì)中miR-21及miR-155的表達(dá)高峰出現(xiàn)在120 h，提示microRNA表達(dá)量變化與AKI相關(guān)。Du等[14]通過分析120例心臟體外循環(huán)術(shù)患者術(shù)后第1日早晨單個時間點的血漿和尿液中的miR-2l表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)量的上升程度與術(shù)后發(fā)生AKI的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，甚至可以對患者是否需要行CRRT治療進(jìn)行預(yù)測，顯示其具有診斷AKI的價值。由此可見，AKI的發(fā)生可能與細(xì)胞缺血缺氧、細(xì)胞凋亡等多種病理過程有關(guān)，miR-21及miR-155通過影響上述病理過程，產(chǎn)生細(xì)胞損傷作用，從而參與AKI的調(diào)控。

應(yīng)用ROC曲線分析顯示，血清miR-21及miR-155診斷AKI的最佳界值分別為2.15、1.28，二者聯(lián)合診斷AKI的AUC優(yōu)于miR-21或miR-155；血清miR-21及miR-155預(yù)測AKI死亡的最佳界值分別為3.35、2.16，二者聯(lián)合預(yù)測AKI死亡的AUC優(yōu)于miR-21或miR-155。相關(guān)分析顯示，AKI患者血清miR-21水平與miR-155水平呈正相關(guān)。說明血清miR-21及miR-155對AKI的診斷及預(yù)后判斷具有一定的價值，二者聯(lián)合檢測有助于提高AKI診斷及預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性。Martino等[15]研究認(rèn)為血漿miR-21水平并不隨著透析而下降，提示血漿miR-21可作為AKI早期診斷及病情進(jìn)展的生物標(biāo)志物，并可用于預(yù)測心臟術(shù)后AKI的預(yù)后情況。馬龍等[16]研究表明miR-21在腎缺血再灌注損傷的不同階段及不同缺血時間會發(fā)生不同程度的表達(dá)量變化，可能是一種較傳統(tǒng)生化指標(biāo)更為優(yōu)越的評估AKI的有效標(biāo)志物。另有研究顯示，miR-155在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，與信號通路有關(guān)，在疾病發(fā)生、發(fā)展的不同階段其表達(dá)譜亦存在差異[17]。由此可見，血清miR-21及miR-155水平與AKI的病情嚴(yán)重程度相關(guān)，有望成為一種新的AKI診斷、分類和預(yù)后判斷的工具。

綜上所述，血清miR-21、miR-155上調(diào)與AKI發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可作為AKI診斷及預(yù)后評估的新型生物標(biāo)志物，二者聯(lián)合檢測有助于提高AKI診斷及預(yù)后評估的準(zhǔn)確性，同時也為理解AKI發(fā)病機(jī)制及治療靶點提供了新的角度。但本研究仍存在很多局限性，如臨床試驗較少、檢測的microRNA數(shù)量少等，今后尚需更多系統(tǒng)的基礎(chǔ)性研究來進(jìn)一步驗證。