滕昊林 于金宇 劉 念 趙 軍 高寶山 薛立娟

(吉林大學第一醫(yī)院泌尿外二科,長春 130021)

腎移植是治療終末期腎病的有效手段之一，而急性排斥反應是腎移植術后最常見的并發(fā)癥，隨著對器官移植免疫研究的不斷深入，臨床針對移植排斥反應所采取的治療措施也更加積極有效，因此有關移植的排斥反應機制及其預防和治療，更加受到科研和臨床醫(yī)務工作者的重視。

IL-17主要由Th17細胞分泌，是一種前炎性細胞因子，它通過促進T細胞成熟和活化、炎細胞聚集、增殖抗原提呈細胞而在移植物局部炎癥反應中發(fā)揮作用，參與急性排斥反應的發(fā)生發(fā)展[1，2]。

本研究使用近交系 SD 大鼠作為供體，Wistar 大鼠作為受體，建立腎移植急性排斥模型，于術后第3、5、7天分別切除移植腎，每組每天6只大鼠，切除的移植腎部分置于10%福爾馬林溶液中固定、切片，隨后行HE、Masson、PAS、PASM等染色，光鏡下診斷急性排斥反應。然后通過RT-PCR擴增腎臟總RNA和對病理切片進行免疫組化的方法檢測剩余腎臟組織中的IL-17。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 RT-PCR 兩步法試劑盒、DNA Marker DL2 000、Trizol(均為日本 TaKaRa公司產(chǎn)品)，IL-17特異性一抗(大鼠)武漢博士德公司，免疫組化UltraSensitiveTMS-P 試劑盒(鼠/兔)，β-actin 218、IL-17引物(大連寶生物)。

1.2實驗方法 將大鼠急性腎移植排斥反應模型分組：正常雄性Wistar大鼠腎臟為正常對照組(Control組)；Wistar大鼠作為供受者的同系基因?qū)φ战M(STX組)；SD大鼠為供者，Wistar大鼠為受者的同種異體移植組(ATX組)；SD大鼠為供者，Wistar大鼠為受者，術后給予CsA的同種異體免疫抑制組(ATX +CsA組)。

每組在術后第3、5、7天獲得6只移植腎，部分置于10%福爾馬林溶液中固定、切片，剩余部分處理，液氮中凍存。大鼠移植腎mRNA按照試劑盒要求提取。逆轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈反應(RT-PCR)，參照試劑盒要求。取20 μl PCR產(chǎn)物在 1%瓊脂糖凝膠上電泳，0.5%溴化乙錠染色 20 min。凝膠成像分析系統(tǒng)拍照及電泳條帶的強度分析，計算每一條目的片段與β-actin 218片段的強度比值，用來表示該目的基因的相對表達水平。

免疫組化染色及結(jié)果的判定，按照試劑盒說明書要求。所有切片在光學顯微鏡下觀察，以集合系統(tǒng)上皮細胞膜有棕褐色染色者為陽性細胞,通過圖像分析測得陽性細胞的灰度值(IOD 值)作為 IL-17蛋白的相對表達量進行分析比較。

2 結(jié)果

2.1移植腎IL-17 mRNA表達特點 大鼠術后第3、5、7天移植腎組織IL-17 mRNA表達詳見表1，其結(jié)果表明，ATX組在第3、5、7天移植腎IL-17 mRNA均明顯升高，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中以第5天為最高(P<0.05)，具有統(tǒng)計學意義。而STX組和ATX+CSA組第3、5、7天移植腎IL-17 mRNA表達與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1～3。

2.2移植腎IL-17免疫組化表達特點 大鼠組術后第 3、5、7天移植腎免疫組化結(jié)果，與正常對照組相比，ATX組大鼠術后第3、5、7天均出現(xiàn)不同程度的急性排斥反應，移植腎IL-17 IOD值均顯著升高(P<0.05)， 以術后第5天移植腎IL-17 IOD值為最高，與術后第3天和第7天相比均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。STX 組、ATX+CsA 組大鼠移植腎術后第3、5、7天IL-17 IOD 值的變化與正常對照組相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2,圖1～3。

表1第3、5、7天IL-17mRNA相對表達量表達

Tab.1RelativeexpressionofIL-17mRNAatday3,5and7

GroupsDay 3Day 5Day 7Control0.895±0.1140.731±0.0530.590±0.142STX0.923±0.1280.757±0.0850.685±0.069ATX1.431±0.0361)1.741±0.0961)1.221±0.0891)ATX+CSA0.916±0.1180.830±0.0460.702±0.040

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

圖1 腎移植術后第3天各組IL-17免疫組化檢測結(jié)果(×200)Fig.1 Immunohistochemical results of Il-17 in each group 3rd day after renal transplantation (× 200)

圖2 腎移植術后第5天各組IL-17免疫組化檢測結(jié)果(×200)Fig.2 Immunohistochemical results of Il-17 in each group 5th day after renal transplantation (× 200)

圖3 腎移植術后第7天各組IL-17免疫組化檢測結(jié)果(×200)Fig.3 Immunohistochemical results of IL-17 in each group 7th day after renal transplantation (× 200)

表2第3、5、7天IL-17免疫組化IOD值

Tab.2IODvaluesofIl-17immunohistochemicalonday3,5and7

GroupsDay 3Day 5Day 7Control6 493.07±1 259.17 6 317.34±1 094.476 521.22±1 147.80STX6 745.04±2 359.28 7 012.24±1 973.126 938.51±2 146.79ATX9 241.19±1 153.621)11 896.17±134.831) 9 587.68±1 306.421)ATX+CSA6 198.42±1 069.856 587.59±1 530.806 387.31±1 429.16

Note：Compared with the control group，P<0.05.

3 討論

早期急性排斥反應是影響移植腎長期存活和失功的重要危險因素之一[3,4]，找到一種能在早期監(jiān)測移植功能狀態(tài)及其預后的指標，是移植免疫學的重要工作和研究熱點。IL-17是具有多種功能的前炎性細胞因子，通過與其受體結(jié)合，促進多種炎性細胞因子釋放，參與機體的免疫反應[5-7]。

在以往的大鼠腎移植模型研究發(fā)現(xiàn)，腎移植后第1天血清中IL-17水平出現(xiàn)增長，第2天開始在移植腎浸潤的單核細胞內(nèi)檢測出明顯表達升高的IL-17，高峰期多出現(xiàn)在第5天[8,9]，本研究亦發(fā)現(xiàn)在ATX組的術后第3天、5天和7天移植腎IL-17表達均明顯升高，與對照組相比，均有統(tǒng)計學意義，尤以第5天表達最顯著，此結(jié)果與文獻報道相符。

越來越多的數(shù)據(jù)證實，IL-17直接或間接在細胞和體液免疫中參與腎移植急性排斥反應的發(fā)生[10-12]，部分結(jié)果表明腎移植術后發(fā)生急性排斥反應時升高的IL-17是早期獨立預測因子，與移植腎預后有關[13]。由此可見IL-17在大鼠免疫排斥反應模型中，早期即可出現(xiàn)，可以作為早期排斥反應的預測指標。

本研究通過檢測大鼠腎臟移植排斥模型中IL-17在術后表達情況的變化，分別比較了大鼠排斥模型術后第3、5、7天的表達，對排斥反應發(fā)生時IL-17表達與移植腎急性排斥反應的相關性及臨床意義進行了闡述，在后續(xù)的進一步研究中，我們力圖探討IL-17表達與體液排斥反應及不同病理分級分期階段的特點和意義，為腎移植術后診斷和防治急性排斥反應的發(fā)生發(fā)展及其預后判斷提供新的實用指標。