劉紅菊，蘇 恒，吳愛(ài)武

(廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院,廣州 510182)

艱難梭菌(Cd)在臨床上可引起抗生素相關(guān)性腹瀉等諸多感染性疾病，統(tǒng)稱為艱難梭菌感染(CDI)，其引起感染的主要毒力因子是產(chǎn)生毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)，TcdA為腸毒素，可引起腸壁分泌大量液體和出血性壞死，臨床通過(guò)檢測(cè)Cd是否產(chǎn)生上述毒素而輔助診斷CDI。TcdA的羧基末端(C端)為重復(fù)的寡肽結(jié)合區(qū)(CROP)，CROP既是TcdA與易感宿主細(xì)胞受體結(jié)合的區(qū)域，同時(shí)也是相應(yīng)抗體阻斷TcdA結(jié)合宿主細(xì)胞表面的位點(diǎn)[1]。適配子是一種可以通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)篩選得到的具有識(shí)別功能的新型寡核苷酸鏈，其本質(zhì)為單鏈DNA(ssDNA)或RNA片段，它們可以形成各種二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊成穩(wěn)定獨(dú)特的三維空間結(jié)構(gòu)，與靶分子配體進(jìn)行高親和力和特異性結(jié)合，與特異性抗體識(shí)別相應(yīng)抗原表位過(guò)程類似，具有庫(kù)容量大、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為實(shí)驗(yàn)室診斷最熱門(mén)的研究領(lǐng)域之一[2-3]。本研究以重組TcdA蛋白為靶分子，采用SELEX技術(shù)，擬篩選與重組TcdA特異性結(jié)合的寡核苷酸適配子，以期為臨床實(shí)驗(yàn)室快速診斷和治療CDI提供一定參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 艱難梭菌產(chǎn)毒素A菌株為純化分離自臨床并保存于廣州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系實(shí)驗(yàn)室的菌株[4],pET-28b為廣州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒；E.coli-DH5α和E.coli-BL21感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2主要試劑 抗艱難梭菌毒素A抗體購(gòu)自Abcom公司；UNIQ-10寡核苷酸純化試劑盒購(gòu)自上海生工科技有限公司；T4 DNA連接酶、DNA Ladder、Premix Taq 聚合酶均購(gòu)自Takara公司；羊抗鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)自Thermo Scientific公司；雙排磁力架、鏈霉親和素磁珠購(gòu)自Invitrogen公司；tRNA購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記-抗地高辛抗體購(gòu)自美國(guó)Jackson公司；TMB檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物有限公司。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3構(gòu)建ssDNA文庫(kù) 構(gòu)建長(zhǎng)度為80 bp的隨機(jī)DNA文庫(kù)，引物和ssDNA文庫(kù)合成及測(cè)序由上海英濰捷基有限公司完成,文庫(kù)中所有ssDNA堿基序列從5′→3′的構(gòu)成如下：5′-AGT CAG TAG TTC AGG CAG CG-40N-CAC AGC ACA CTC ACA CGC AC-3′，若中間為n個(gè)堿基的隨機(jī)序列，則ssDNA文庫(kù)量可達(dá)4n，本研究文庫(kù)中所有ssDNA序列中間為40個(gè)隨機(jī)堿基序列，意味著本研究的DNA隨機(jī)文庫(kù)容量可達(dá)440。用于鏈霉親和素磁珠篩選的生物素標(biāo)記物放在下游引物和中間的40個(gè)隨機(jī)堿基序列之間，即5′-AGT CAG TAG TTC AGG CAG CG-40N-biotin-CAC AGC ACA CTC ACA CGC AC-3′。

1.4方法

1.4.1艱難梭菌毒素A羧基末端序列的克隆、表達(dá)與純化 對(duì)純化獲得的重組TcdA蛋白采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行分析，并進(jìn)行蛋白免疫印跡法(Western blot)鑒定[5]。

1.4.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增優(yōu)化反應(yīng)條件摸索 以合成的ssDNA隨機(jī)文庫(kù)作為模板，采用上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得雙鏈DNA(dsDNA)，以ddH2O作為模板設(shè)立陰性對(duì)照。根據(jù)引物的解鏈溫度設(shè)置不同退火溫度，分別進(jìn)行經(jīng)5、8、12、16、20、24、28個(gè)循環(huán)數(shù)的PCR。經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察試驗(yàn)結(jié)果，確定對(duì)稱PCR的最優(yōu)退火溫度和循環(huán)次數(shù)。

1.4.3SELEX篩選 根據(jù)文獻(xiàn)[6]操作流程進(jìn)行TcdA適配子的SELEX篩選，取預(yù)定量純化重組蛋白TcdA包被于96孔板，同時(shí)用ddH2O設(shè)空白對(duì)照，4 ℃包被過(guò)夜，洗滌3次，空白對(duì)照孔和蛋白包被孔分別用3%牛血清清蛋白(BSA)封閉2 h。用10 pmol/μL的ssDNA先與空白對(duì)照孔結(jié)合45 min，反篩去除與BSA結(jié)合的ssDNA，并測(cè)定此時(shí)ssDNA濃度，再與蛋白包被孔結(jié)合45 min，洗滌6次，加入洗脫緩沖液在80 ℃下加熱15 min，洗脫下與TcdA結(jié)合的ssDNA，回收ssDNA并測(cè)定其濃度,每輪篩選所用量見(jiàn)表1。采用下游引物5′端標(biāo)記生物素引物，PCR擴(kuò)增ssDNA成dsDNA后，用0.1 mol/L的NaOH解離dsDNA成ssDNA，再采用鏈霉親和素包被磁珠分選并獲得反義ssDNA作為下一輪篩選的模板文庫(kù)，如此重復(fù)直至ssDNA文庫(kù)與TcdA結(jié)合率不再增加為止。

1.4.4ssDNA文庫(kù)與TcdA結(jié)合率測(cè)定 篩選純化后所得ssDNA文庫(kù)的總量與反篩后ssDNA文庫(kù)總量比值，即每輪文庫(kù)與蛋白的結(jié)合率。

表1 不同篩選輪數(shù)重組蛋白TcdA及ssDNA用量

1.4.5文庫(kù)的克隆和測(cè)序 將第12輪獲得的ssDNA擴(kuò)增為dsDNA后，與pMDTM 19-T載體進(jìn)行連接，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞于LB/氨芐青霉素/X-Gal/異丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)平板培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取60個(gè)轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序。

1.4.6適配子同源性和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，分別選擇DNA MAN軟件和mfold軟件進(jìn)行序列同源性和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

1.4.7適配子-A22(Apt-A22)親和常數(shù)(KA)測(cè)定

1.4.7.1重組TcdA包被濃度確定 96微孔板每孔加入200 μL濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL TcdA重組蛋白，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照孔，4 ℃包被過(guò)夜，洗滌3次后，空白對(duì)照孔和蛋白包被孔均加入200 μL封閉液，37 ℃封閉2 h。去除封閉液，洗滌緩沖液洗滌4次。在各蛋白孔中分別加入200 μL的40 ng/μL的Apt-A22溶液，37 ℃孵育2 h，洗滌緩沖液洗滌4次，向各反應(yīng)孔中加入200 μL HRP標(biāo)記的地高辛抗體稀釋液(稀釋度為1∶10 000)，37 ℃孵育45 min，磷酸鹽緩沖液洗滌5次，加入100 μL 3,3′5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色劑后37 ℃孵育30 min，后加入100 μL終止液終止反應(yīng)，測(cè)定其光密度(OD)450值。

2 結(jié) 果

2.1TcdA在大腸埃希菌中的表達(dá)與鑒定 pET-28b-TcdA重組表達(dá)質(zhì)粒的最佳表達(dá)條件為菌液600 nm波長(zhǎng)OD值選擇0.6，誘導(dǎo)溫度為25 ℃，IPTG誘導(dǎo)終濃度取1.0 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間取10 h，在35×103處出現(xiàn)了目的蛋白(泳道4)。按照此條件誘導(dǎo)重組質(zhì)粒，收集細(xì)菌裂解液上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，目的蛋白表達(dá)量高，見(jiàn)圖1。Western blot結(jié)果顯示，TcdA抗體可識(shí)別目的蛋白，不能識(shí)別pET-28b菌株蛋白，見(jiàn)圖2。

注：1表示蛋白Marker條帶；2表示pET-28b經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的上清液；3表示pET-28b經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的沉淀；4表示pET-28b-TcdA經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的上清液；5表示pET-28b-TcdA經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的沉淀

圖1 pET-28b-TcdA重組質(zhì)粒在最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件下

菌液裂解液SDS-PAGE電泳分析

注：1表示PET-28b菌株蛋白；2表示目的蛋白

圖2目的蛋白的Western blot鑒定

2.2PCR擴(kuò)增優(yōu)化反應(yīng)條件 采用ssDNA文庫(kù)作為模板時(shí)，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中對(duì)其循環(huán)數(shù)與引物特異性退火溫度進(jìn)行摸索，結(jié)果顯示，在退火溫度為55 ℃、循環(huán)數(shù)為8時(shí)，目的條帶顯示為單一條帶，且無(wú)非特異性條帶出現(xiàn)，見(jiàn)圖3。

注：M表示10 bp DNA Ladder；1表示PCR循環(huán)數(shù)為5；2表示PCR循環(huán)數(shù)為8；3表示PCR循環(huán)數(shù)為12；4表示PCR循環(huán)數(shù)為16；5表示PCR循環(huán)數(shù)為20；6表示PCR循環(huán)數(shù)為24；7表示PCR循環(huán)數(shù)為28

圖3采用ssDNA文庫(kù)作為模板進(jìn)行PCR時(shí)

不同循環(huán)數(shù)下擴(kuò)增結(jié)果

2.3各輪ssDNA隨機(jī)文庫(kù)與TcdA結(jié)合率 經(jīng)過(guò)12輪篩選，至第10、11、12輪篩選后適配子結(jié)合率變化不明顯，說(shuō)明結(jié)合率峰值趨于飽和，達(dá)到44.6%，見(jiàn)圖4。

圖4 各輪隨機(jī)文庫(kù)與TcdA結(jié)合率

2.4克隆測(cè)序結(jié)果 TcdA篩選后克隆測(cè)序的有效適配子為50條。

2.5適配子序列同源性和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 測(cè)序的50條有效適配子進(jìn)行多序列比對(duì)，總體同源性為45.27%。將具有90%以上同源性的序列歸為一組，可分為6組：第1組包括Apt-A1、Apt-A3、Apt-A13、Apt-A23、Apt-A25、Apt-A37、Apt-A40、Apt-A57，其中前5個(gè)適配子序列完全相同，而Apt-A37、Apt-A57序列中均只有1個(gè)堿基與上述序列不同；第2組包括Apt-A5、Apt-A55，二者序列完全相同；第3組包括Apt-A17、Apt-A36，二者序列完全相同；第4組包括Apt-A14、Apt-A27、Apt-A58、Apt-A60、Apt-A43，其中前4個(gè)適配子序列完全相同，Apt-A43與前4條序列只有1個(gè)堿基不同；第5組包括Apt-A44、Apt-A59，二者序列完全相同；第6組包括Apt-A22、Apt-A29，二者序列完全相同。見(jiàn)表2。其余序列同源性均較低。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的TcdA適配子是Apt-A22，其自由能為dG=-1.30 kcal/mol。

2.6適配子KA測(cè)定

2.6.1重組蛋白TcdA包被濃度確定 當(dāng)倍比系列濃度(2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL)重組蛋白TcdA包被時(shí)，其OD450值分別為1.145、0.623、0.417、0.234、0.175、0.096、0.065，在蛋白濃度為2、1、0.5 μg/mL時(shí)，OD450值均在0.15～2.50，說(shuō)明在此范圍內(nèi)OD值與包被板的重組蛋白濃度有一定線性關(guān)系。選定重組蛋白濃度分別為2、1、0.5 μg/mL時(shí)，測(cè)定其與二級(jí)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的適配子Apt-A22的反應(yīng)曲線。

表2 重組蛋白TcdA經(jīng)12輪SELEX篩選后獲得的同源性適配子序列

2.6.2Apt-A22與重組蛋白TcdA的KA測(cè)定 蛋白濃度為2 μg/mL、OD450為50%時(shí)，Apt-A22濃度約為1.373 ng/μL；蛋白濃度為1 μg/mL，OD450為50%時(shí)，Apt-A22濃度約為2.194 ng/μL；蛋白濃度為0.5 μg/mL、OD450為50%時(shí)，Apt-A22濃度約為3.76 ng/μL。將上述值代入公式計(jì)算相應(yīng)KA，KA1=3.06×107M-1；KA2=1.60×107M-1；KA3=2.08×107M-1。因此適配子Apt-A22與重組蛋白TcdA的KA=2.25×107M-1，見(jiàn)圖5。

圖5 Apt-A22與TcdA重組蛋白親和曲線

3 討 論

TcdA的羧基末端可結(jié)合易感靶細(xì)胞表面的受體，介導(dǎo)TcdA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1]。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)檢測(cè)TcdA羧基末端的存在，可輔助臨床診斷和阻斷CDI。本課題組前期工作已通過(guò)系列試驗(yàn)在成功構(gòu)建pET-28b-TcdA羧基末端表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌BL21中，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及獲得純化目的蛋白，為相應(yīng)適配子的篩選提供研究基礎(chǔ)。

在適配子篩選過(guò)程中，隨機(jī)文庫(kù)的構(gòu)建、每輪PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化、靶蛋白與文庫(kù)結(jié)合濃度的調(diào)整、次級(jí)文庫(kù)的制備等都是影響篩選的重要因素，需要進(jìn)行反復(fù)摸索與驗(yàn)證。本研究體外合成的ssDNA文庫(kù)隨機(jī)序列由40個(gè)堿基組成，理論上有440個(gè)隨機(jī)堿基序列文庫(kù)容量,可滿足SELEX篩選量的需要。在整個(gè)SELEX技術(shù)篩選過(guò)程中要多次重復(fù)進(jìn)行對(duì)稱PCR擴(kuò)增，以ssDNA隨機(jī)文庫(kù)作為模板，通過(guò)對(duì)稱PCR，可獲得大量dsDNA，這些dsDNA通過(guò)鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)分離隨機(jī)文庫(kù)，可獲得大量ssDNA，作為下一輪的篩選文庫(kù)。PCR擴(kuò)增條件對(duì)PCR結(jié)果影響較大，為了獲得大量且特異性強(qiáng)的dsDNA產(chǎn)物，必須對(duì)PCR擴(kuò)增循環(huán)條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究通過(guò)優(yōu)化PCR循環(huán)條件，結(jié)果顯示，在退火溫度為55.0 ℃、8個(gè)循環(huán)的條件下，于80 bp Ladder處成功檢測(cè)到單一而清晰的條帶，說(shuō)明文庫(kù)構(gòu)建成功。

文庫(kù)濃度與靶蛋白濃度比例是SELEX篩選過(guò)程中重要的環(huán)節(jié)之一，在初始階段，由于文庫(kù)中高親和力適配子濃度低，因此，在初始的幾輪篩選中，需使用較高濃度靶蛋白進(jìn)行篩選。隨著篩選輪數(shù)增加，結(jié)合力更高、特異性更強(qiáng)的適配子相對(duì)富集，而親和力低的適配子逐漸淘汰，靶蛋白及ssDNA隨機(jī)文庫(kù)的用量均減少，但文庫(kù)量與靶蛋白濃度相對(duì)比例升高，使結(jié)合力更強(qiáng)的ssDNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到相應(yīng)的靶蛋白的結(jié)合靶點(diǎn)，以獲得特異性更強(qiáng)的適配子。本研究從第2輪開(kāi)始加入tRNA，與ssDNA非特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合靶蛋白，也有利于從隨機(jī)文庫(kù)淘汰低親和力的適配子。當(dāng)篩選到第10～12輪時(shí)，結(jié)合率不再增加，說(shuō)明目標(biāo)適配子已得到富集。ssDNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是靶分子與適配子特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，適配子主要是靠氫鍵和電荷與電荷之間的相互作用識(shí)別蛋白質(zhì)[8-9]。本試驗(yàn)采用適配子文庫(kù)的此特性，篩選出50條重組蛋白毒素A的有效適配子，通過(guò)同源樹(shù)圖進(jìn)行分組，將同源性達(dá)到90%的分為一組，共分為6組。每個(gè)適配子序列相差1個(gè)堿基，其二級(jí)結(jié)構(gòu)相差較大，適配子的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)為主，莖環(huán)結(jié)構(gòu)可由序列的各個(gè)區(qū)域組成。適配子二級(jí)結(jié)構(gòu)中的莖環(huán)越小，莖越長(zhǎng)，則其結(jié)合力越好[10]。因此，根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，選擇結(jié)合力較好的適配子Apt-A22進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的親和力計(jì)算。

BEATTY等[7]建立的測(cè)定抗原-抗體KA測(cè)定方法已被廣泛應(yīng)用，適合測(cè)定抗體和包被抗原之間的KA，且隨后他們從理論到實(shí)踐均進(jìn)行了驗(yàn)證，嚴(yán)格控制ELISA時(shí)，其質(zhì)量作用定律仍然適用。本研究利用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行TcdA與適配子KA測(cè)定和計(jì)算，Apt-A22的KA均值為2.25×107M-1，對(duì)應(yīng)的解離常數(shù)值為44.5 nM，KA均到達(dá)107級(jí)，解離常數(shù)達(dá)到了nM級(jí)別。與OCHSNER等[11]篩選出的TcdA適配子和目前唯一被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床治療的適配子比較，KA和解離常數(shù)相當(dāng)[12]，由此說(shuō)明本試驗(yàn)所篩選的適配子有一定應(yīng)用前景。

綜上所述，本研究成功利用SELEX技術(shù)篩選獲得了特異結(jié)合TcdA的高親和力的ssDNA適配子，有利于進(jìn)一步研究各適配子與TcdA的親和力和結(jié)合位點(diǎn)，為后續(xù)適配子的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。