潘婉舒彭 楊杜大釗吳遠(yuǎn)明劉 芳王 瑞敖曉琳,3劉書亮,3

PAN Wan-shu1 PENG Yang1 DU Da-zhao2 WU Yuan-ming2 LIU Fang1 WANG Rui1 AO Xiao-lin1,3 LIU Shu-liang1,3

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014；2. 四川保寧醋有限公司，四川 閬中 637400；3. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014)

(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China; 2. Sichuan Baoning Vinegar Co., Ltd., Langzhong, Sichuan 637400, China; 3. Research Institute of Food Processing and Security, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China)

四川麩醋以麩皮為主要原料，通過傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝精釀而成[1]，尤以保寧醋最為有名，為中國傳統(tǒng)的四大名醋之一。麩醋發(fā)酵醅內(nèi)含較多疏松料，可容納一定的空氣和水，固、液、氣三相共存，適合多種微生物生長繁殖。麩曲常用人工培養(yǎng)曲霉菌制得，作為食醋發(fā)酵過程中的糖化劑[2]。食醋釀造過程中曲的種類與質(zhì)量影響食醋生產(chǎn)周期、成品醋的品質(zhì)及出醋率的高低。四川麩醋現(xiàn)在大多是生料固態(tài)開放性多種微生物共同發(fā)酵，醋酸菌作為發(fā)酵的主要微生物之一，主要來源于回糟、生產(chǎn)原料及環(huán)境，其豐度較低使醋酸發(fā)酵相對(duì)較弱，導(dǎo)致食醋的產(chǎn)率較低[3-6]；同時(shí)，食醋中乙酸含量在有機(jī)酸組分中相對(duì)較低，保寧醋中乙酸的含量僅占總酸含量的27.09%[7]，可能一定程度影響了主體風(fēng)味形成。因此，為了利于生產(chǎn)實(shí)施，非常有必要在四川麩醋傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵中強(qiáng)化優(yōu)良醋酸菌，而食醋發(fā)酵過程中麩曲的制備和醋酸菌的應(yīng)用也被越來越多學(xué)者關(guān)注。

實(shí)際生產(chǎn)中，受到生產(chǎn)成本、原料選擇、釀造工藝等因素限制，菌種種子液的生物量難以達(dá)到最適的接種濃度。郭明燁等[8]通過對(duì)醋酸菌培養(yǎng)條件、米酒培養(yǎng)基酒精質(zhì)量分?jǐn)?shù)、接種量進(jìn)行優(yōu)化，醋酸菌種子液的最大生物量僅達(dá)到107CFU/mL，種子液的生物量較低。同時(shí)，醋醅中含水量多，會(huì)導(dǎo)致實(shí)際生產(chǎn)中食醋成熟期延長，對(duì)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益產(chǎn)生影響。李玉斌等[9]以四川保寧醋為研究對(duì)象，在其發(fā)酵過程中添加醋酸菌二級(jí)種子液作為生物強(qiáng)化劑，但是液體種子液的添加影響食醋風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生和食醋成熟期的延長。因此，這些研究所采用的方法仍未達(dá)到較佳的工業(yè)利用價(jià)值。

為進(jìn)一步提高醋酸菌種子的生物量、嚴(yán)格把控食醋品質(zhì)、控制食醋發(fā)酵周期，本研究以前期篩選出的優(yōu)良巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianum)C9-4[10]作為固態(tài)醋醅發(fā)酵的生物強(qiáng)化菌株，擬采用響應(yīng)面法對(duì)醋酸菌制備成麩曲種子進(jìn)行工藝優(yōu)化，為解決上述問題和進(jìn)一步在四川麩醋固態(tài)發(fā)酵中實(shí)現(xiàn)醋酸菌麩曲強(qiáng)化接種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianus)C9-4：從四川保寧醋醋醅中分離，保存于本實(shí)驗(yàn)室；

麩皮：市售；

醋酸菌液體培養(yǎng)基：酵母膏1 g/100 mL，葡萄糖1 g/100 mL，121 ℃滅菌20 min，使用前加入3 mL/100 mL無水乙醇；

醋酸菌平板及斜面保藏培養(yǎng)基：醋酸菌液體培養(yǎng)基添加瓊脂粉1.8 g/100 mL，CaCO31.5 g/100 mL；

麩皮培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱取麩皮10 g于250 mL三角瓶中，按麩皮質(zhì)量的90 mL/100 g加入蒸餾水，拌和均勻，蒸料滅菌(121 ℃)20 min，滅菌后趁熱搖動(dòng)三角瓶使料塊分散、冷卻備用。

1.2 儀器與設(shè)備

精密電子天平：TE412-L型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-40AI型，上海三電醫(yī)療核子儀器廠；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DHG-9162型，上海一恒科技有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS24型，上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及種子液的制備 取菌株C9-4劃線于醋酸菌斜面，30 ℃培養(yǎng)24 h，活化2次。取菌株斜面物用5 mL無菌生理鹽水洗下菌體并調(diào)整醋酸菌濃度至108CFU/mL，制成一級(jí)醋酸菌種子。

將一級(jí)醋酸菌種子液按5 mL/100 g接種至麩皮培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制成二級(jí)醋酸菌種子。

1.3.2 三角瓶曲的制作及生長曲線測定 在三角瓶麩皮培養(yǎng)基中加入乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，接種5 mL/100 g 的二級(jí)醋酸菌種子。置于30 ℃條件下培養(yǎng)，每6 h取樣一次測定醋酸菌菌落總數(shù)，72 h后完成生長曲線測定，確定三角瓶曲的最適培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參照1.3.2制曲方法，根據(jù)文獻(xiàn)[9]固定麩皮10 g，選擇乙酸含量、乙醇含量、水分、醋酸菌接種量、氧含量作為影響麩曲醋酸菌菌落總數(shù)的主要因素，通過單因素試驗(yàn)結(jié)果選取響應(yīng)面的因素和水平。

(1) 水分對(duì)麩曲醋酸菌菌落總數(shù)的影響：乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，接種量5 mL/100 g，膠塞，麩皮培養(yǎng)基中水分含量分別設(shè)為110 g/100 g·麩皮，100 g/100 g·麩皮，90 g/100 g·麩皮，80 g/100 g·麩皮，70 g/100 g·麩皮，30 ℃ 發(fā)酵48 h結(jié)束后取樣并測定醋酸菌菌落總數(shù)。

(2) 乙酸含量對(duì)麩曲醋酸菌菌落總數(shù)的影響：水分按麩皮質(zhì)量的90 g/100 g·麩皮，乙醇3 mL/100 g，接種量5 mL/100 g，膠塞，麩皮培養(yǎng)基中乙酸含量分別設(shè)為0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL/100 g，30 ℃發(fā)酵48 h結(jié)束后取樣并測定醋酸菌菌落總數(shù)。

(3) 乙醇含量對(duì)麩曲醋酸菌菌落總數(shù)的影響：水分按麩皮質(zhì)量的90 g/100 g·麩皮，乙酸2 mL/100 g，接種量5 mL/100 g，膠塞，麩皮培養(yǎng)基中乙醇添加量分別設(shè)為1，2，3，4，5 mL/100 g，30 ℃發(fā)酵48 h結(jié)束后取樣并測定醋酸菌菌落總數(shù)。

(4) 接種量對(duì)麩曲醋酸菌菌落總數(shù)的影響：水分按麩皮質(zhì)量的90 g/100 g·麩皮，乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，膠塞，麩皮培養(yǎng)基中醋酸菌接種量分別設(shè)為2，4，6，8，10 mL/100 g，30 ℃發(fā)酵48 h結(jié)束后取樣并測定醋酸菌菌落總數(shù)。

(5) 氧含量對(duì)麩曲醋酸菌菌落總數(shù)的影響：水分按麩皮質(zhì)量的90 g/100 g·麩皮，乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，接種量5 mL/100 g，麩皮培養(yǎng)基分別用4層紗布、棉塞、硅膠塞控制氧含量，30 ℃發(fā)酵48 h結(jié)束后取樣并測定醋酸菌菌落總數(shù)。

通過SPSS 22顯著性分析確定顯著影響因素。

1.3.4 響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇顯著影響的3個(gè)因素，用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，以醋酸菌菌落總數(shù)為響應(yīng)值，建立預(yù)測模型并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終確定三角瓶曲最優(yōu)制備條件。

1.3.5 麩曲制備工藝的應(yīng)用 應(yīng)用上述優(yōu)化的工藝參數(shù)，在某食醋生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行麩曲的生產(chǎn)，通過三角瓶、曲盤、種子罐、曲床對(duì)醋酸菌進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)培制備麩曲。

(1) 三角瓶及曲盤的醋酸菌麩曲制備同文中確定的三角瓶麩曲制備工藝。

(2) 醋酸菌種子罐培養(yǎng)條件：采用霉菌種曲機(jī)進(jìn)行制備。60 kg粗麩皮、水分按麩皮質(zhì)量的90 g/100 g·麩皮、接種量5 mL/100 g，30 ℃下持續(xù)通風(fēng)補(bǔ)濕培養(yǎng)48 h。

(3) 醋酸菌厚層通風(fēng)制曲條件：采用厚層通風(fēng)曲床制備。800 kg粗麩皮、水分按麩皮質(zhì)量的100 g/100 g·麩皮、接種量3 mL/100 g，風(fēng)機(jī)作用濕度32 ℃，持續(xù)補(bǔ)濕培養(yǎng)48 h。在麩曲擴(kuò)培過程中取樣測定醋酸菌的菌落總數(shù)。

1.4 醋酸菌菌落計(jì)數(shù)

將樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取適宜稀釋度2～3個(gè)，每個(gè)稀釋液吸取1 mL加入平皿中，每個(gè)稀釋液重復(fù)2個(gè)平皿，傾注法添加醋酸菌固體培養(yǎng)基，混勻、凝固、倒置于培養(yǎng)箱中，30 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌在三角瓶麩皮培養(yǎng)基的生長曲線

將巴氏醋桿菌C9-4接種至三角瓶麩皮培養(yǎng)基中，測定生長曲線如圖1所示。由圖1可知，前24 h內(nèi)醋酸菌處于遲緩期，24～48 h為對(duì)數(shù)生長期，48 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，確定醋酸菌的培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

圖1 巴氏醋桿菌C9-4在麩皮培養(yǎng)基中的生長曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙酸添加量對(duì)醋酸菌生長的影響 三角瓶麩曲培養(yǎng)基中醋酸菌初始濃度為1.15×106CFU/g。由圖2可知，經(jīng)過單因素方差分析后顯示不同濃度底酸添加量差異顯著(P<0.05)，隨著底酸濃度的增加，醋酸菌數(shù)量先增加后減少，底酸添加量<2 mL/100 g時(shí)醋酸菌數(shù)量級(jí)>107，而添加量為4 mL/100 g時(shí)數(shù)量級(jí)僅為105，說明低濃度的底酸有利于醋酸菌的生長繁殖，而較高濃度的底酸能明顯抑制醋酸菌的生長甚至導(dǎo)致部分醋酸菌細(xì)胞死亡，與文獻(xiàn)[11]所得結(jié)果一致。因此，底酸添加量控制在1 mL/100 g左右為宜。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2 乙醇添加量對(duì)醋酸菌生長的影響 三角瓶麩曲培養(yǎng)基中醋酸菌初始濃度為1.64×106CFU/g。由圖3可知，經(jīng)過單因素方差分析后2 mL/100 g梯度與其他組醋酸菌總數(shù)差異顯著，但多重比較時(shí)僅5 mL/100 g 梯度與其他組差異極顯著(P<0.01)，1～4 mL/100 g的乙醇添加量對(duì)醋酸菌生長影響不大，都能達(dá)到107數(shù)量級(jí)，其中2 mL/100 g乙醇添加量可使醋酸菌數(shù)量達(dá)到較大值，可能是在底酸的作用下，醋酸菌可利用適量乙醇產(chǎn)酸后受到一定抑制。因此，乙醇添加量控制在2 mL/100 g左右為宜。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 水分添加量對(duì)醋酸菌生長的影響 三角瓶麩曲培養(yǎng)基中醋酸菌初始濃度為1.16×106CFU/g。由圖4可知，經(jīng)過單因素方差分析后90 g/100 g·麩皮梯度與其他組差異顯著，醋酸菌在水分含量>80 g/100 g·麩皮時(shí)生長較為旺盛，數(shù)量級(jí)均可以達(dá)到107，在水分添加量為90 g/100 g·麩皮時(shí)達(dá)到最大值，因此選用此條件為后續(xù)優(yōu)化條件。因此，水分添加量控制在90 g/100 g·麩皮為宜。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 接種量對(duì)醋酸菌生長的影響 三角瓶麩曲培養(yǎng)基中醋酸菌初始濃度為1.66×106CFU/g。由圖5可知，隨著接種量的增加醋酸菌生長呈現(xiàn)先增長后降低的趨勢(shì)，經(jīng)過單因素方差分析4 mL/100 g梯度與其他組差異顯著，但5組數(shù)據(jù)生長均達(dá)到107，多重比較時(shí)4 mL/100 g與6 mL/100 g 2個(gè)梯度與其他組差異極顯著(P<0.01)，因此響應(yīng)面選取2，4，6 mL/100 g 3個(gè)梯度。

2.2.5 氧含量對(duì)醋酸菌生長的影響 三角瓶麩曲培養(yǎng)基中醋酸菌初始濃度為1.18×106CFU/g。醋酸菌屬于好氧菌，但是由于培養(yǎng)時(shí)間只有48 h，三角瓶中有足夠的氧氣供醋酸菌生長繁殖，因此三角瓶不同的封口方式對(duì)其生長繁殖產(chǎn)生影響不明顯，見圖6。因此，三角瓶應(yīng)選取3種塞子均可。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 5 The influence of the amount of inoculation on the growth ofA.pasteurianumC9-4 (n=3)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 6 The influence of the amount of oxygen component on the growth ofA.pasteurianumC9-4 (n=3)

2.3 回歸模型的建立與檢驗(yàn)

2.3.1 因素與水平的選擇 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇變量中對(duì)醋酸菌菌落總數(shù)影響顯著的乙酸、乙醇、接種量作為影響因子，以醋酸菌菌落總數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，因素編碼及水平見表1。

2.3.2 回歸模型的建立與檢驗(yàn) 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2，每個(gè)試驗(yàn)做3組平行，取其平均值。采用Design. Expert 8.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，分析結(jié)果見表3，得到醋酸菌菌落總數(shù)對(duì)乙酸、乙醇、接種量的二元多項(xiàng)式回歸模型為：

(1)

表1 響應(yīng)面因素水平表

圖7、8分別為多因素之間的交互作用對(duì)醋酸菌菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面圖與等高線圖。當(dāng)響應(yīng)面分析圖為山谷曲面，并且特征值均為正值，該響應(yīng)面有極小值存在；當(dāng)響應(yīng)面分析圖為山丘曲面，并且特征值為負(fù)值，該響應(yīng)面有極大值存在；當(dāng)響應(yīng)面分析圖為馬鞍曲面，并且特征值有正有負(fù)，無極值存在[12-15]。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析?

? **：P<0.01；*：P<0.05；R2=98.05%；校正R2=94.55%。

圖7 交互作用對(duì)醋酸菌菌落總數(shù)影響的響應(yīng)面圖

Figure 7 The influence of ethanol, acetic acid and inoculation dose concentration on the number of acetic acid bacter of response surface

2.3.3 醋酸菌麩曲制備工藝條件的確定及驗(yàn)證 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design-Expert 8.0軟件獲得了醋酸菌麩曲制備最佳工藝條件為：乙酸添加量1.03 mL/100 g、乙醇添加量2.09 mL/100 g、醋酸菌接種量4.09 mL/100 g，此條件下醋酸菌菌落總數(shù)的預(yù)測值為1.62×108CFU/g(lg值8.21)。在以上優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以2.59×107CFU/g醋酸菌菌落總數(shù)為初始接種量，所得醋酸菌總數(shù)可達(dá)1.38×108CFU/g(lg值8.14)，與預(yù)測值較為接近。

圖8 交互作用對(duì)醋酸菌菌落總數(shù)影響的等高線圖

Figure 8 The influence of ethanol, acetic acid and inoculation dose concentration on the number of acetic acid bacter of contourplots

2.4 醋酸菌麩曲逐級(jí)擴(kuò)培結(jié)果

采用響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果對(duì)醋酸菌麩曲進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，通過三角瓶、曲盤、種子罐、曲床培養(yǎng)出的麩曲，醋酸菌總數(shù)分別為1.83×108，1.66×108，2.60×108，6.35×108CFU/g。醋酸菌在擴(kuò)培過程中菌落總數(shù)均能達(dá)到108CFU/g，證明本試驗(yàn)優(yōu)化的醋酸菌麩曲制備條件可用于實(shí)際生產(chǎn)，所得醋酸菌麩曲比液態(tài)醋酸菌種子含水量低，醋酸菌數(shù)高，可望解決液態(tài)發(fā)酵劑會(huì)增大醋醅含水量和延長醋醅成熟期的問題。

3 結(jié)論

(1) 本試驗(yàn)將巴氏醋桿菌(Acetobacterpasteurianum)C9-4作為麩曲發(fā)酵菌株，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，建立了醋酸菌麩曲制備工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，并得出醋酸菌麩曲制備的最佳工藝條件為乙酸添加量1.03 mL/100 g、乙醇添加量2.09 mL/100 g、醋酸菌接種量4.09 mL/100 g，麩曲醋酸菌菌含量達(dá)到108CFU/g 以上，滿足醋酸菌接種要求。

(2) 將優(yōu)化的醋酸菌麩曲的最佳制備條件應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，通過三角瓶、曲盤、種子罐及曲床逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)制備麩曲，擴(kuò)培過程中醋酸菌總數(shù)均能達(dá)到108CFU/g，滿足實(shí)際應(yīng)用醋酸菌菌種數(shù)量級(jí)要求。研究結(jié)果對(duì)醋酸菌麩曲制備及強(qiáng)化醋酸菌接種發(fā)酵、提高四川麩醋的出醋率、增加乙酸含量和改良麩醋主體風(fēng)味物質(zhì)具有參考價(jià)值。由于大生產(chǎn)試驗(yàn)過程中生產(chǎn)環(huán)境不可控因素較多，在后續(xù)的研究中，還應(yīng)該加強(qiáng)試驗(yàn)環(huán)境條件等方面的控制。