梁 霞 呂曉玲

LIANG Xia LU Xiao-ling

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

(School of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

甘草屬于豆科植物，主要生長(zhǎng)在歐洲和亞洲南部。甘草中含有甘草酸、多糖、類黃酮等許多活性成分，其中，最重要的活性成分之一是甘草酸(Glycyrrhizic Acid，GL)。甘草酸的甜度大約是蔗糖的200倍，且熱量低，安全無毒，其甜味可在口腔中保持較長(zhǎng)時(shí)間，是理想的天然甜味劑，已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。此外，由于甘草酸具有抗病毒、抗氧化、抗癌等特性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。

從甘草中提取甘草酸是分離得到甘草酸的先導(dǎo)步驟。目前已報(bào)道[3-6]的甘草酸提取方法主要有傳統(tǒng)提取法和現(xiàn)代提取法。傳統(tǒng)提取法主要包括水提法、有機(jī)溶劑提取法和索氏提取法等，這些方法存在操作時(shí)間長(zhǎng)、甘草酸提取率低、有機(jī)溶劑回收困難進(jìn)而污染環(huán)境等缺點(diǎn)?，F(xiàn)代提取法主要包括酶提取法、超聲波提取法、微波提取法等，這些方法相比傳統(tǒng)提取方法提取率有所提高，但僅使用其中一種方法耗費(fèi)的時(shí)間仍較長(zhǎng)，能耗較大。近年來，采用兩種方法兩步提取植物中有效成分的研究逐漸成為熱門課題。龍佳朋等[7]研究了復(fù)合酶法、氨性乙醇浸提法兩步提取甘草酸的工藝，結(jié)果顯示，復(fù)合酶法、氨性乙醇浸提法兩步提取甘草酸的總操作時(shí)間為3.5 h，最終得到甘草酸的提取率僅85.02%。為改善現(xiàn)有甘草酸提取方法的操作時(shí)間長(zhǎng)、提取率低等不足，本研究擬結(jié)合復(fù)合酶法的條件溫和、環(huán)保優(yōu)勢(shì)與超聲法的高效優(yōu)勢(shì)，采用復(fù)合酶和超聲輔助兩步法提取甘草中的甘草酸，探求其最佳工藝條件。旨在為甘草酸的提取研究提供新方法、新思路，為甘草酸的實(shí)際提取應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

甘草酸對(duì)照品：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

烏拉爾甘草：廣東天誠(chéng)中藥飲片有限公司；

纖維素酶：活力≥1×104U/g，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；

果膠酶：活力1×104U/g，南寧東恒華道生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型,昆山市超聲儀器有限公司；

高效液相色譜儀(UV檢測(cè)器)：LC-20A型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 甘草酸的測(cè)定方法 采用高效液相色譜法。參考文獻(xiàn)[8]修改如下,色譜條件：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：0.1%磷酸—水，流動(dòng)相B：乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；梯度洗脫參數(shù)如表1所示。

表1 高效液相色譜梯度洗脫參數(shù)

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取甘草酸對(duì)照品1，2，3，4，5，6 mg于100 mL容量瓶中，用70%乙醇溶解，定容，搖勻，取適量過0.45 μm有機(jī)濾膜，按1.2.1方法測(cè)其峰面積。以各甘草酸對(duì)照品溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積值S為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：S=1E+07C+14 947，相關(guān)系數(shù)R2=1.000 0，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線在濃度為0.01～0.06 mg/mL時(shí)呈線性關(guān)系。

1.2.3 甘草原料中甘草酸總含量的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[9]修改如下：將甘草原料粉碎，過三號(hào)篩(50目)，干燥至恒重，精密稱取0.2 g于250 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，在功率為250 W，頻率為40 kHz的條件下超聲處理30 min，冷卻，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減少的重量，搖勻，4 700 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀再按上述藥典方法重復(fù)提取4次后，棄沉淀，合并5次提取所得上清液，并按1.2.1方法測(cè)其峰面積值，按式(1)計(jì)算甘草原料中總甘草酸含量。

(1)

式中：

P——原料中甘草酸含量，%；

C——甘草酸濃度，mg/mL；

V——甘草酸提取液體積，mL；

m——原料質(zhì)量，g。

1.2.4 復(fù)合酶法提取階段的工藝流程及操作要點(diǎn)

工藝流程：甘草→粉碎→過篩→干燥→復(fù)合酶法提取→滅酶→離心→甘草酸提取液

操作要點(diǎn)：

(1) 過篩：將粉碎后的甘草粉末分別過20，40，60，80目篩。

(2) 干燥：需將過篩后的甘草粉末干燥至恒重。

(3) 復(fù)合酶法提取：用pH為4.5的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液分別配制酶活均為100 U/mL果膠酶溶液和纖維素酶溶液；精密稱取1 g甘草粉末于250 mL具塞錐形瓶中，按設(shè)定量加入提取液(磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液)和纖維素酶、果膠酶溶液，于設(shè)定溫度的恒溫水浴鍋中提取甘草酸。

(4) 滅酶：酶解完成后，沸水滅酶10 min。

(5) 離心：冷卻，搖勻后，4 700 r/min離心10 min。

1.2.5 甘草酸提取率的計(jì)算 取適量甘草酸提取液，測(cè)定甘草酸濃度，按式(2)計(jì)算甘草酸提取率。

(2)

式中：

R——甘草酸提取率，%；

n——稀釋倍數(shù)；

C——甘草酸濃度，mg/mL；

V——甘草酸提取液體積，mL；

m——原料質(zhì)量，g；

P——原料中甘草酸總含量，%。

1.2.6 復(fù)合酶法提取階段的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 復(fù)合酶比例：固定加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、酶解時(shí)間1.5 h、酶解溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25(g/mL)，研究復(fù)合酶比例[果膠酶∶纖維素酶為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6 (U/U)]對(duì)甘草酸提取率的影響。

(2) 加酶量：固定復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3 (U/U)、pH 4.5、時(shí)間1.5 h、溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究加酶量(35，70，105，140，175，210，245 U/g·底物)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(3) pH：固定復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3 (U/U)、加酶量70 U/g·底物、時(shí)間1.5 h、溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究pH(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(4) 酶解時(shí)間：固定復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3(U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、溫度45 ℃、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究酶解時(shí)間(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(5) 溫度：固定復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3(U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、時(shí)間1.5 h、甘草粒度40目、料液比1∶25 (g/mL)，研究溫度(35，40，45，50，55，60 ℃)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(6) 原料粒度：固定復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3(U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、時(shí)間1.5 h、溫度45 ℃、料液比1∶25 (g/mL)，研究原料粒度(20，40，60，80目)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(7) 料液比：固定復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)1∶3 (U/U)、加酶量70 U/g·底物、pH 4.5、時(shí)間1.5 h、溫度45 ℃、甘草粒度40目，研究料液比[1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35 (g/mL)]對(duì)甘草酸提取率的影響。

1.2.7 復(fù)合酶法提取階段的工藝優(yōu)化 以單因素研究為參考，在最優(yōu)復(fù)合酶比例、pH和料液比的條件下，根據(jù)響應(yīng)面法(Response Surface Method，RSM)優(yōu)化設(shè)計(jì)原理，選擇Box-Benhnken設(shè)計(jì)方法，以加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、原料粒度為自變量，甘草酸提取率為響應(yīng)值，建立四因素三水平RSM分析試驗(yàn)。

1.2.8 超聲輔助提取階段的工藝流程及操作要點(diǎn)

工藝流程：復(fù)合酶法提取→滅酶→冷卻→加入70%乙醇→超聲法提取→離心→甘草酸提取液

操作要點(diǎn)：

(1) 復(fù)合酶法提?。喊?.2.7最佳條件進(jìn)行甘草酸的提取。

(2) 加入70%乙醇：通過濃縮或補(bǔ)加相同緩沖液使滅酶冷卻后的提取液至一定體積，再加入一定量70%乙醇，使最終提取體系中的料液比及乙醇濃度至設(shè)定值。

1.2.9 超聲輔助提取階段的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 乙醇濃度：固定料液比1∶35 (g/mL)、超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、超聲溫度40 ℃，研究乙醇濃度(11%，14%，17%，20%，23%，26%)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(2) 料液比：固定提取溶劑為20%乙醇、超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、超聲溫度40 ℃，研究料液比[1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45 (g/mL)]對(duì)甘草酸提取率的影響。

(3) 超聲功率：固定提取溶劑為20%乙醇、料液比1∶35(g/mL)、超聲時(shí)間15 min、超聲溫度40 ℃，研究超聲功率(200，250，300，350，400 W)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(4) 超聲時(shí)間：固定提取溶劑為20%乙醇、料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W、超聲溫度40 ℃，研究超聲時(shí)間(5，10，15，20，25，30 min)對(duì)甘草酸提取率的影響。

(5) 超聲溫度：固定提取溶劑為20%乙醇、料液比1∶35(g/mL)、超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min，研究超聲溫度(30，35，40，45，50 ℃)對(duì)甘草酸提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草原料中總甘草酸的含量

參照《藥典2010》從原料中提取甘草酸5次，可基本將甘草酸完全提出。計(jì)算得原料中總甘草酸含量為3.72%。

2.2 復(fù)合酶法提取階段的單因素試驗(yàn)

2.2.1 復(fù)合酶比例對(duì)甘草酸提取率的影響 在復(fù)合酶總量一定時(shí)，隨著復(fù)合酶比例變化，纖維素酶量增加，果膠酶量減少，甘草酸提取率呈先增加后減小趨勢(shì)，見圖1。這是由于甘草細(xì)胞壁中纖維素多于果膠，破壁時(shí)所需纖維素酶量大于果膠酶量，故隨著纖維素酶的增加甘草酸提取率增大，而果膠酶量過少時(shí)，會(huì)導(dǎo)致復(fù)合酶破壁能力減弱，使甘草酸溶出量減少，提取率下降[10]。在復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)為1∶3 (U/U)時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大。所以最佳復(fù)合酶比例(果膠酶∶纖維素酶)為1∶3 (U/U)。

圖1 復(fù)合酶比例對(duì)甘草酸提取率的影響

Figure 1 Effect of the ratio of combined enzymes on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.2 加酶量對(duì)甘草酸提取率的影響 如圖2所示，當(dāng)加酶量<175 U/g·底物時(shí)，隨復(fù)合酶量的增加，提取率逐漸升高；當(dāng)加酶量>175 U/g·底物時(shí)，復(fù)合酶過量，進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)合酶相互附著[11]，酶與底物傳質(zhì)效率降低，甘草酸提取率下降；當(dāng)加酶量為175 U/g·底物時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大。因此，最佳復(fù)合酶量為175 U/g·底物。

圖2 加酶量對(duì)甘草酸提取率的影響

Figure 2 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.3 酶解pH對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)pH<5.5時(shí)，隨著pH的增大，復(fù)合酶活性升高，破壁能力加強(qiáng)，甘草酸提取率增加；當(dāng)pH>5.5時(shí)，復(fù)合酶活性下降，甘草酸提取率下降[12]；當(dāng)pH為5.5時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大，見圖3。因此，最佳pH為5.5。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)酶解時(shí)間<1 h時(shí)，酶解反應(yīng)不完全，甘草酸提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間>1 h時(shí)，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，甘草酸溶出量逐步減少，甘草酸提取率增加不明顯[12]；當(dāng)酶解時(shí)間為1 h時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大，見圖4。綜合考慮，選擇1 h為最佳酶解時(shí)間。

2.2.5 酶解溫度對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)溫度<50 ℃時(shí)，隨溫度的上升，復(fù)合酶活性增加，破壁能力加強(qiáng)，甘草酸提取率升高；當(dāng)溫度>50 ℃時(shí)，較高溫度使復(fù)合酶活性降低，破壁能力減弱，進(jìn)而甘草酸提取率下降[13]，當(dāng)溫度為50 ℃ 時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大，見圖5。因此，最佳酶解溫度為50 ℃。

圖3 酶解pH對(duì)甘草酸提取率的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響

Figure 4 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of glycyrrhizic acid

圖5 酶解溫度對(duì)甘草酸提取率的影響

Figure 5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.6 原料粒度對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)原料粒度<40目時(shí)，隨原料粒度的減小，甘草細(xì)胞與復(fù)合酶接觸面積增大，破壁能力加強(qiáng)，甘草酸的溶出量增加，甘草酸提取率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)原料粒度>40目時(shí)，隨原料粒度的減小，雜質(zhì)溶出量增加，大量雜質(zhì)處于酶解體系中影響甘草酸的溶出，甘草酸提取率下降；當(dāng)原料粒度為40目時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大，見圖6。因此，最佳甘草原料粒度為40目。

圖6 原料粒度對(duì)甘草酸提取率的影響

Figure 6 Effect of particle size of raw material on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.2.7 料液比對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)料液比>1∶25(g/mL)時(shí)，隨溶劑量的增加，更多的甘草酸溶于提取液中，甘草酸提取率逐漸升高；當(dāng)料液比<1∶25 (g/mL)時(shí)，由于過多的提取液使復(fù)合酶濃度與底物濃度均下降，進(jìn)而酶與底物的接觸機(jī)會(huì)減少，甘草酸提取率降低[13]，當(dāng)料液比為1∶25 (g/mL)時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大，見圖7。因此，最佳料液比為1∶25 (g/mL)。

圖7 料液比對(duì)甘草酸提取率的影響

Figure 7 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction rate of glycyrrhizic acid

2.3 RSM優(yōu)化復(fù)合酶法提取階段的工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素、水平及編碼 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素、水平及編碼見表2。

2.3.2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

2.3.3 回歸模型及方差分析 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸，得甘草酸提取率關(guān)于加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、原料粒度的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素、水平及編碼

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

Y=67.70+0.30A-0.52B-0.37C+0.19D+0.098AB+0.065AC-0.42AD-0.39BC-0.45BD-0.76CD-4.59A2-2.07B2-1.58C2-1.14D2。

(3)

結(jié)果顯示，A及D對(duì)甘草酸提取率影響顯著，B及C對(duì)甘草酸提取率影響極顯著；交互項(xiàng)AD、BC對(duì)甘草酸提取率影響顯著，交互項(xiàng)BD、CD對(duì)甘草酸提取率影響極顯著，其他交互項(xiàng)不顯著；各二次項(xiàng)對(duì)甘草酸提取率影響均為極顯著。各因素對(duì)甘草酸提取率影響由小到大排列順序?yàn)椋涸狭６?加酶量<酶解溫度<酶解時(shí)間。

表4 模型方差分析

2.3.4 響應(yīng)面分析及優(yōu)化結(jié)果 運(yùn)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件繪制甘草酸提取率與各因素交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面關(guān)系圖(見圖8)。

如圖8所示，甘草酸提取率與各因素交互項(xiàng)的響應(yīng)曲面關(guān)系圖均為開口向下的光滑曲面，甘草酸提取率均有最大值，且甘草酸提取率達(dá)到最大值時(shí)所對(duì)應(yīng)的各因素水平與單因素試驗(yàn)研究結(jié)果基本相符，進(jìn)一步說明Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)所選取的因素水平適宜[13]。

同時(shí)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件預(yù)測(cè)出復(fù)合酶法提取甘草酸的最佳工藝條件為：復(fù)合酶量176.64 U/g·底物，時(shí)間0.94 h，溫度48.62 ℃，原料粒度43目，且在此最佳工藝條件下甘草酸提取率預(yù)測(cè)值為67.78%。為方便實(shí)際操作，將參數(shù)修正為：復(fù)合酶量176.6 U/g·底物，時(shí)間0.94 h，溫度48 ℃，原料粒度40目，進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得甘草酸平均提取率為67.22%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.18%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.83%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值基本相符，表明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法提取甘草酸的工藝條件切實(shí)可行，但該實(shí)際值低于中心試驗(yàn)點(diǎn)所得甘草酸提取率，因此選擇中心試驗(yàn)點(diǎn)為復(fù)合酶法提取甘草酸的最佳工藝條件，即最佳復(fù)合酶量175 U/g·底物，時(shí)間1 h，溫度50 ℃，原料粒度40目。

按1.2.4方法及2.3所得最佳工藝條件對(duì)甘草酸進(jìn)行連續(xù)提取，結(jié)果顯示，連續(xù)提取2次后甘草酸提取率為(68.81±0.21)%，連續(xù)提取3次后甘草酸提取率僅為(69.10±0.18)%，表明增加復(fù)合酶法提取甘草酸的次數(shù)已無法大幅提高甘草酸提取率，所以需要輔以其他方法來進(jìn)一步使甘草酸從細(xì)胞中溶出，進(jìn)而提高甘草酸提取率，避免甘草資源浪費(fèi)。

圖8 各因素交互作用對(duì)甘草酸提取率的影響

2.4 超聲輔助提取階段的單因素試驗(yàn)

2.4.1 乙醇濃度對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)乙醇濃度<20%時(shí)，甘草酸提取率急劇增大，說明在超聲和提取溶劑乙醇的存在下，更多甘草酸由細(xì)胞溶出；當(dāng)乙醇濃度>20%時(shí)，乙醇濃度對(duì)甘草酸提取率影響不大，甘草酸提取率增加極緩慢，見圖9。為節(jié)約成本，選擇乙醇濃度20%為最佳。

2.4.2 料液比對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)料液比>1∶35 (g/mL)時(shí)，隨溶劑量的增加，甘草酸與提取溶劑的濃度差增大，甘草酸更易溶出，甘草酸提取率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)料液比<1∶35 (g/mL)時(shí)，由于溶劑量太大，使單位體積提取液所受超聲的機(jī)械、空化等作用降低[14]，甘草酸提取率下降。當(dāng)料液比為1∶35 (g/mL)時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大，見圖10。因此，最佳提取料液比為1∶35 (g/mL)。

2.4.3 超聲功率對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)超聲功率為200～400 W時(shí)，隨超聲功率的增大，超聲產(chǎn)生的機(jī)械和空化等作用增強(qiáng)，進(jìn)而甘草酸的溶出量增大，甘草酸提取率增加[14]。當(dāng)超聲功率>350 W時(shí)，超聲功率對(duì)甘草酸溶出量的影響減小，甘草酸提取率隨超聲功率的增加而緩慢平穩(wěn)增加，見圖11。為節(jié)約能源，減小噪音，選擇超聲功率350 W為最佳。

Figure 9 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of glycyrrhizic acid

圖10 料液比對(duì)甘草酸提取率的影響

Figure 10 Effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of glycyrrhizic acid

圖11 超聲功率對(duì)甘草酸提取率的影響

2.4.4 超聲時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響 當(dāng)超聲時(shí)間<15 min 時(shí)，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，甘草酸的溶出量增加，甘草酸提取率逐漸上升；當(dāng)超聲時(shí)間>15 min時(shí)，超聲時(shí)間對(duì)甘草酸的溶出量影響不大，甘草酸提取率幾乎不增加，見圖12。為節(jié)約能源與時(shí)間，選擇超聲時(shí)間15 min為最佳。

2.4.5 超聲溫度對(duì)甘草酸提取率的影響 如圖13所示，當(dāng)溫度<40 ℃時(shí)，隨溫度的上升，甘草酸在提取溶劑中的擴(kuò)散速率增加，甘草酸更易從原料中溶出，甘草酸提取率升高[15]；當(dāng)溫度>40 ℃時(shí)，隨溫度的升高，提取體系中液體表面張力降低，且由超聲產(chǎn)生的空化泡內(nèi)的壓力增大，進(jìn)而超聲波的阻尼增大，甘草酸提取率下降[16]；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，甘草酸提取率達(dá)到最大。因此，最佳超聲溫度為40 ℃。

圖12 超聲時(shí)間對(duì)甘草酸提取率的影響

圖13 超聲溫度對(duì)甘草酸提取率的影響

在上述最佳條件下，按照1.2.8方法，進(jìn)行復(fù)合酶和超聲輔助兩步法提取甘草酸，試驗(yàn)為3個(gè)平行試驗(yàn)，得甘草酸平均提取率為90.44%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.14%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%，說明本研究復(fù)合酶和超聲輔助兩步法提取甘草酸的工藝條件真實(shí)可靠，穩(wěn)定性較好，在實(shí)際生產(chǎn)中具有參考價(jià)值。謝果等[17]以乙醇為提取溶劑，研究了超聲波法提取甘草酸的工藝，結(jié)果顯示，超聲波法提取甘草酸的總操作時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2.5 h，且甘草酸提取率僅為87.4%。

3 結(jié)論

通過對(duì)復(fù)合酶和超聲輔助兩步法提取甘草中甘草酸的工藝進(jìn)行研究，最終得到復(fù)合酶和超聲輔助兩步法提取甘草酸的最佳工藝條件，且在最佳工藝條件下甘草酸的提取率可達(dá)(90.44±0.14)%。因此，復(fù)合酶和超聲輔助兩步法適用于甘草酸的提取，與傳統(tǒng)提取法、超聲波提取法及復(fù)合酶法、氨性乙醇浸提法兩步提取相比，具有提取率高、總操作時(shí)間短(1.25 h)、條件溫和、高效等優(yōu)點(diǎn)。

甘草中含有許多活性成分，在采用復(fù)合酶和超聲輔助兩步法提高甘草酸提取率的同時(shí)，是否會(huì)導(dǎo)致其他雜質(zhì)增多，進(jìn)而增加甘草酸純化難度，本試驗(yàn)未作驗(yàn)證，今后將加以深入研究。