陳瑩瑩，葛淑珍，黃健，張也，向先蘭，武陽，晏彪，馬萍,*

1. 湖北科技學院藥學院，咸寧 437100 2. 湖北科技學院基礎醫(yī)學院，環(huán)境-免疫與神經系統疾病實驗室，咸寧 437100

鄰苯二甲酸酯類物質(PAEs)是由鄰苯二甲酸(phthalate acid)酯化衍生的一系列酯類化合物，作為增塑劑使用時，可以從塑料制品中遷移到環(huán)境，造成環(huán)境的污染(包括食物污染)，并通過呼吸道、消化道和皮膚粘膜進入人體內，對人體健康造成潛在危害[1]。鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)作為PAEs中的一種，是目前使用量較大的增塑劑之一，主要用于食品包裝材料[2]。有關DINP的毒性的報道諸多，有研究表明，DINP可在大鼠體內誘導過氧化物酶的生成，進而誘導肝腫瘤[3]。Ma等[4]的研究也發(fā)現，DINP可導致肝臟和腎臟出現病理變化，會致肝腎組織發(fā)生脂質過氧化和DNA損傷。Saillenfait等[5]對Sprague-Dawley大鼠進行DINP的口服染毒實驗，發(fā)現DINP能導致其胚胎發(fā)育毒性和產后畸形。

動物實驗發(fā)現某些PAEs具有典型的類雌激素作用，這種作用主要是由于“雌激素核受體介導效應”所致[6]：即增塑劑進入細胞后，首先與雌激素核受體結合，隨即受體復合物發(fā)生構型變化，在核內與雌激素反應基因的特異DNA序列結合，啟動基因表達，從而在特異性靶組織中表現出生物效應。例如被鄰苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)染毒的雄性嚙齒類動物，可以表現出生殖系統畸形，包括：附睪發(fā)育不全、隱睪、尿道下裂、輸精管、前列腺異常等，以及肛殖距的縮短和乳頭殘留，雄性不育等[7]。2005年美國Rochester大學的Swan等[8]針對134名2～36個月齡的男性嬰兒進行流行病學研究表明，孕婦產前接觸較高濃度水平的鄰苯二甲酸酯，可能使男嬰生殖系統出現畸形。Boberg等[9]研究發(fā)現高于300 mg·(kg·d)-1劑量的DINP對Wistar大鼠有抗雄性激素作用，具有生殖毒性。肛門生殖器距離(anogenital distance, AGD，簡稱“肛殖距”)的縮短是生殖系統畸形的一個表現，Bornehag等[10]研究發(fā)現，孕婦產前DINP暴露可以導致新生兒AGD縮短。目前，國內對DINP生殖毒性的研究并不多，本實驗以雄性昆明小鼠為實驗材料，通過測定不同劑量DINP作用下睪丸組織的活性氧(ROS)、還原型谷胱甘肽(GSH)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量以及DNA-蛋白質交聯(DPC)系數的變化，同時觀察睪丸組織切片的病理變化，探究DINP對雄性小鼠生殖毒性的氧化損傷機制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物

42只SPF級雄性昆明小鼠(23～25 g)購買自湖北省實驗動物研究中心(實驗動物許可證號為：SYXK(鄂)2013-0071；動物質量合格證號：No:42000600001035)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：Hide Chameleon V多功能熒光酶標儀(芬蘭Hidex公司)，Power wave XS酶標儀(美國Bio-Tek公司)，DP73光學顯微鏡(日本Olympus公司)，5415R低溫冷凍機、5424/5424R離心機(德國Eppendorf公司)，RM2245切片機(德國LEICA公司)，HH-42三用電熱溫水箱(北京長源實驗儀器廠)，MX-S可調式渦旋儀(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)。

主要試劑：鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP，≥99.6%，Sigma公司)，Hoechst33258熒光染料(≥98%，Sigma公司)，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA，>99.9%，Sigma公司)，蛋白酶K(Proteinase K，≥ 30 units·mg-1protein，Sigma公司)，還原型谷胱甘肽試劑盒(南京建成生物工程研究所)，三羥基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCL，分析純，Amresco分裝)，5,5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，小鼠8-OHdG ELISA試劑盒(濟南朋遠生物技術有限公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，褪黑素(Melatonin，≥98%，Sigma公司)。

1.3 動物分組與染毒

42只昆明雄性小鼠，隨機分為7組，包括1個空白對照組(生理鹽水)，4個DINP暴露組，1個褪黑素對照組，1個褪黑素+DINP組，每組6只。根據已有的研究[4]，以0.2、2、20、200 mg·kg-1定為暴露組的染毒劑量，以生理鹽水稀釋成0.02、0.2、2、20 mg·mL-14種濃度的使用液，稀釋過程中加與DINP等體積的吐溫80(VDINP:V吐溫80=1:1)助溶，因吐溫80僅為DINP的助溶劑，量很小，對生物體無毒無副作用，所以陰性對照組只是給予生理鹽水。稀釋液現用現配，使用前在旋渦混懸儀上充分混勻。50 mg·kg-1的褪黑素用3%乙醇和無菌生理鹽水配制而成[11]。對于褪黑素+DINP組，給予小鼠200 mg·kg-1DINP 3 h后給藥50 mg·kg-1褪黑素。每組均經口灌胃給予，灌胃量為10 mL·kg-1，每天一次，連續(xù)染毒14 d，分別于實驗前稱小鼠體重并記錄。

1.4 睪丸組織切片的制備和觀察

染毒結束后用頸椎脫臼法處死小鼠，立即取睪丸組織并用4%多聚甲醛將其固定，常規(guī)脫水，石蠟切片，H&E染色，普通光學顯微鏡下觀察睪丸組織的病理組織學變化。

1.5 睪丸組織勻漿和細胞懸液的制備

經稱重處理后的睪丸組織置于冰冷PBS(pH=7.5)中漂洗，濾紙拭干，分成兩部分，一部分睪丸組織加冰冷的PBS制成10%(mg·mL-1)勻漿液，4 ℃、10 000×g離心10 min后取上清，用于ROS、GSH和8-OHdG的檢測。另一部分睪丸組織剪成≈1 mm3糜狀組織塊，4層擦鏡紙過濾，將濾液在200 g離心5 min后棄上清，用PBS重懸細胞制備細胞懸液。

1.6 ROS含量的測定

取睪丸組織勻漿上清液4 μL，加入396 μL PBS作100倍稀釋。取100 μL稀釋液于酶標板中排列，加入100 μL熒光染料DCFA-DA染色，37 ℃中避光反應5 min，用熒光酶標儀檢測485 nm激發(fā)光、528 nm發(fā)射光的熒光強度，熒光強度以相對熒光單位(RFU)表示。

1.7 GSH含量和蛋白質含量的測定

GSH含量的測定嚴格按照試劑盒操作說明進行。GSH含量(μmol·g-1prot)=[(測定OD值-空白OD值)/(標準OD值-空白OD值)]×標準管濃度×樣本稀釋倍數÷待測勻漿蛋白濃度(g prot·L-1)。蛋白含量按照Folin-酚法測定。

1.8 8-OHdG含量的測定

8-OHdG含量的測定嚴格按照試劑盒操作說明進行，以0, 3, 6, 12, 24, 48 ng·mL-1等標準品濃度為橫坐標，以450 nm處OD值為縱坐標，繪制標準曲線，根據標準曲線來確定樣品中8-OHdG的含量。

1.9 DPC系數的測定

DPC采用KCL-SDS沉淀法進行檢測[12-13]，分別測定交聯DNA的含量(用A表示)和原液中游離DNA的含量(用B表示)，DPC系數用公式η=A/(A+B)表示。

1.10 統計分析

采用SPSS 12.0統計分析軟件進行統計分析，多組間均數用比較實用的單因素方差分析(ANOVA)，然后使用最小顯著性差異法(LSD)檢測兩組間均數的差異性，P<0.05，P<0.01表示差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 小鼠睪丸組織形態(tài)的光鏡觀察結果

如圖1所示：空白對照組切片中睪丸組織結構正常，生精小管正常、無脫落，各級生精細胞排列整齊，層次清楚，結構正常，管腔中可見大量精子。0.2 mg·kg-1DINP組生精小管未脫落，各級生精細胞排列基本完整，結構尚可，管腔中可見數目尚可的精子。2 mg·kg-1DINP組生精上皮可見零星脫落，生精細胞排列紊亂，管腔內精子數目少。20 mg·kg-1DINP組生精細胞明顯脫落入管腔，上皮變薄，可見空泡，管腔內精子數目明顯減少；睪丸細胞損傷明顯，可見病理性核分裂像。200 mg·kg-1DINP組大量生精細胞脫落入管腔，上皮明顯變薄，管腔內精子的數目極少或無；睪丸細胞結構破壞，壞死明顯。與空白對照組相同，50 mg·kg-1褪黑素組睪丸組織結構和細胞形態(tài)正常，而200 mg·kg-1DINP+50 mg·kg-1褪黑素組生精細胞部分脫落，部分完整，管腔內可見脫落的生精細胞和大量精子。結果表明，隨著DINP暴露劑量的加大，小鼠睪丸細胞的病理損傷越嚴重。由于褪黑素的保護，睪丸細胞損傷現象有所緩解，也表明了此損傷為氧化損傷，褪黑素可以改善DINP所致的氧化損傷。

圖1 不同處理組小鼠睪丸切片圖(10×40，H&E染色)注：DINP為鄰苯二甲酸二異壬酯，Mel為褪黑素。Fig. 1 Testis slices of mice in different groups (10×40, H&E stains)Note: DINP is diisononyl phthalate; Mel is melatonin.

圖2 不同處理組小鼠睪丸ROS含量注：n=6，F=4.2436，P<0.01，A～E組的比較；經LSD檢驗，與對照組相比較，* P<0.05；# P<0.05，G組與E組比較。Fig. 2 ROS content in mouse testis of different groupsNote: n=6, F=4.2436, P<0.01, comparison among group A-E; by LSD test, * P<0.05, compared with control group; # P<0.05, comparison between group G and E.

圖3 不同處理組小鼠睪丸GSH含量注：n=6，F=3.6326，P<0.05，A～E組的比較；經LSD檢驗，與對照組相比較，* P<0.05，** P<0.01；# P<0.05，G組與E組比較。Fig. 3 GSH content in mouse testis of different groupsNote: n=6, F=3.6326, P<0.05, comparison among group A-E; by LSD test, * P<0.05, ** P<0.01, compared with control group; # P<0.05, comparison between group G and E.

2.2 小鼠睪丸組織ROS含量的變化

ROS含量是反映機體氧化應激水平的指標。圖2可見不同處理組睪丸組織的ROS含量的變化，隨著DINP暴露劑量的升高，ROS含量逐漸上升，并呈一定的劑量-效應反應。與空白對照組比較，0.2、2 mg·kg-1DINP組差異無統計學意義，20、200 mg·kg-1DINP組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。較高劑量的DINP能造成ROS含量的上升。與單獨200 mg·kg-1的DINP組比較，200 mg·kg-1DINP+50 mg·kg-1褪黑素組的ROS含量顯著下降。

2.3 小鼠睪丸組織GSH含量的變化

GSH是GPx(谷胱甘肽過氧化物酶)催化過氧化物還原的必需底物，故GSH含量也可反應機體抗氧化應激的水平。圖3可見不同處理組睪丸組織的GSH含量的變化，隨著DINP暴露劑量的升高，GSH含量逐漸下降，呈一定的劑量-效應反應。與空白對照組比較，0.2、2 mg·kg-1劑量組差異無統計學意義，20、200 mg·kg-1劑量組有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。較高劑量的DINP可使小鼠睪丸GSH含量明顯下降。與單獨200 mg·kg-1的DINP組比較，200 mg·kg-1DINP+50 mg·kg-1褪黑素組中的GSH含量顯著上升。

2.4 小鼠睪丸組織8-OHdG含量的變化

不同處理組睪丸組織的8-OHdG含量的變化見圖4。隨著DINP染毒劑量的升高，8-OHdG含量逐漸上升。與空白對照組相比，0.2、2 mg·kg-1DINP組差異無統計學意義，20、200 mg·kg-1DINP組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。較高劑量的DINP能造成ROS含量的上升。與單獨200 mg·kg-1的DINP組比較，200 mg·kg-1DINP+50 mg·kg-1褪黑素組中的8-OHdG含量明顯減少。

圖4 不同處理組小鼠睪丸8-OHdG含量注：n=6，F=16.1475，P<0.01，A～E組的比較；經LSD檢驗，與對照組相比較，** P<0.01；## P<0.01，G組與E組比較。Fig. 4 8-OHdG content in mouse testis of different groupsNote: n=6, F=16.1475, P<0.01 , comparison among group A-E; by LSD test, ** P<0.01, compared with control group; ## P<0.01, comparison between group G and E.

2.5 小鼠睪丸DPC系數的變化

如圖5所示，隨著DINP暴露劑量的升高，DPC系數逐漸上升，呈一定的劑量-效應關系。與空白對照組相比，0.2、2 mg·kg-1DINP組差異無統計學意義，20、200 mg·kg-1DINP組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。較高劑量的DINP能造成DPC系數的上升。與單獨200 mg·kg-1的DINP組比較，200 mg·kg-1DINP+50 mg·kg-1褪黑素組DPC系數明顯下降。

圖5 不同處理組小鼠睪丸DPC系數注：n=6，F=3.2805，P<0.05，A～E組的比較；經LSD檢驗，與對照組相比較，* P<0.05；# P<0.05，G組與E組比較。Fig. 5 DPC coefficients in mouse testis of different groupsNote: n=6, F=3.2805, P<0.05 , comparison among group A-E; by LSD test, * P<0.05, compared with control group; # P<0.05, comparison between group G and E.

3 討論(Discussion)

ROS是分子氧在還原過程中的一系列中間產物[14]，其含量反應細胞內氧自由基水平，ROS的累積可以導致氧化應激的產生，氧化應激可使組織出現不同程度的損傷。還原型的GSH作為預防性抗氧化劑，是ROS的主要清除劑，GSH的消耗可以反應機體的氧化損傷程度，在評價氧化損傷中具有重要意義[15-16]。本研究中，隨著DINP暴露劑量的升高，ROS含量逐漸上升，GSH含量逐漸下降。與空白對照組相比，20、200 mg·kg-1DINP組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，說明在較高劑量的DINP誘導下小鼠睪丸組織細胞內產生了過量的ROS，以致細胞的抗氧能力下降。

ROS可造成DNA損傷，表現為DNA分子堿基修飾和鏈斷裂兩大類。8-OHdG是最具代表性的堿基修飾產物，其只能通過DNA氧化損傷途徑形成，可作為評價DNA氧化損傷的重要指標之一[17]。DNA斷裂可以與蛋白質結合形成DPC，DPC對DNA的構象和功能可以產生嚴重影響，并易造成某些嚴重疾病的產生[18]。在本研究中隨著DINP暴露劑量的升高，8-OHdG含量和DPC系數逐漸上升，與空白對照組比較，20，200 mg·kg-1DINP組差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)，說明較高劑量的DINP能使小鼠睪丸8-OHdG的形成及DNA和蛋白質交聯增多，造成睪丸組織的DNA損傷。

褪黑素是松果體分泌的一種神經內分泌激素，既可以清除脂溶性又可以清除水溶性自由基，抗氧化作用顯著[19]。本研究中，200 mg·kg-1DINP+褪黑素組與200 mg·kg-1DINP組相比較，睪丸組織的ROS、8-OHdG含量和DPC系數均顯著下降，GSH含量顯著上升，睪丸組織的病理損傷減輕，說明褪黑素對睪丸組織的氧化作用有拮抗作用。

有研究表明DBP對雄性生殖系統有毒性作用，慢性、持續(xù)性地破壞Rasd1 MEK1/2以及Bcl-2/Bax的表達，不同劑量的DBP引起雄性大鼠生殖發(fā)育毒性，包括肛殖距(AGD)降低，睪丸的組織學損傷，以及生精小管細胞凋亡[20]。但也有對男性生殖損害的研究，并未發(fā)現PAEs代謝產物與精液常規(guī)指標、精子凋亡、精子DNA損傷存在顯著關聯，認為其對成年男性生殖作用影響較輕[21]。DINP作為PAEs中的一種，本實驗研究證明了DINP對雄性小鼠有氧化損傷作用，具有生殖毒性，為揭示PAEs生殖毒性機制奠定了基礎。

綜上：通過對睪丸組織進行病理學觀察發(fā)現，隨著DINP暴露劑量的升高，小鼠睪丸細胞的病理損傷越嚴重。20 mg·kg-1劑量時，生精細胞明顯脫落入管腔，上皮變薄，管腔內精子數目明顯減少；睪丸細胞損傷明顯，可見病理性核分裂像。200 mg·kg-1劑量時，大量生精細胞脫落入管腔，上皮明顯變薄，精子數目極少或無；睪丸結構破壞，壞死明顯。

較高劑量的DINP(≥20 mg·kg-1)能使小鼠睪丸組織細胞內產生過量的ROS，破壞自身的氧化與抗氧化平衡，使細胞抗氧化能力下降，以致小鼠睪丸組織的8-OhdG的形成及DNA和蛋白質交聯的增多，造成了氧化損傷和病理損傷，從而造成了小鼠的生殖毒性，褪黑素對睪丸組織的氧化作用有拮抗作用。